線粒體(mitochondrion)，是細胞的“能量工廠”，線粒體內有一套獨立於細胞核的遺傳物質——線粒體DNA(mtDNA)，人類mtDNA的長度為16569bp，擁有37個基因，編碼13種蛋白，這些蛋白都參與細胞的能量代謝。

        由於線粒體在能量穩態中的重要作用，mtDNA中的單堿基突變就可導致發育障礙、神經肌肉疾病、癌症進展等等多種人類疾病。因此，開發針對mtDNA的基因編輯工具一直是線粒體遺傳學領域的長期目標。在mtDNA中精確誘導堿基突變，有助於解釋這些突變在發病機製中的作用，也可作為相應的治療方法。

        第一代基因編輯技術ZFN和第二代基因編技術TALEN，可以靶向含有特定基因突變的mtDNA，從而消除突變的mtDNA。但這兩種方法都隻能消除mtDNA，而不能引入特定的序列變化。

        第三代基因編輯技術CRISPR，包括Cas9、Base Editor、Prime Editor，需要gRNA引導Cas蛋白與目標DNA結合，但目前並無有效方法將外源RNA高效導入線粒體內，這導致基於CRISPR的基因編輯工具無法應用於線粒體基因編輯。

        近日，北京大學未來技術學院汪陽明實驗室在 Nature Communications 期刊發表了題為：DddA homolog search and engineering expand mitochondrial base editing 的研究論文。

        該研究鑒定了多個來源於微生物中的雙鏈DNA脫氨酶(DddA)，並將其中一種改造成為線粒體堿基編輯器。

        2018年，Joseph Mougous 教授實驗室的博士後 Marco de Moraes 在伯克霍爾德菌中無意間發現了一種細菌毒素——DddA，DddA可以在DNA雙鏈上催化胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)，這是前所未見的。

        此後，Joseph Mougous 教授與劉如謙團隊合作，於2020年7月8日，在 Nature 期刊發表了題為：A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的研究論文。

        該研究開發了一種不依賴CRISPR的堿基編輯器——DdCBE，能夠實現對線粒體基因組(mtDNA)的精準編輯，為研究線粒體遺傳病和治療線粒體遺傳病帶來了前所未有的工具。該研究也被認為是“問鼎線粒體研究領域的聖杯”。

        該研究基於DddA，它可以催化雙鏈DNA(dsDNA)中胞苷的脫氨，將胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)。將DddA分裂半體與轉錄激活子樣效應子陣列蛋白(TALE)和尿嘧啶糖基化酶抑製劑融合，產生無RNA的DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器——DdCBE，可催化人mtDNA中C?G到T?A的轉化。

        2022年4月4日，劉如謙團隊在 Nature Biotechnology 期刊發表了題為：CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA 的研究論文。

        劉如謙團隊對線粒體堿基編輯器DdCBE進行了重要升級，通過噬菌體輔助連續進化(PACE)和噬菌體輔助非連續進化(PANCE)技術對DdCBE進行定向改造，開發出了兩個升級版DdCBE，這兩個升級版DdCBE不僅具有更高的編輯效率，還具有更廣泛的序列編輯範圍，除了編輯線粒體基因，還能編輯細胞核DNA。

        這項研究為在人類線粒體中進行高效基因編輯提供了新工具，也大大提高了對全蛋白堿基編輯的有效性和適用性。

        然而，劉如謙團隊開發的這類線粒體堿基編輯器的序列兼容性較低，例如DdCBE隻對T之後的C有較高的編輯效率，編輯後將C突變為U，該堿基將被識別為T。而他開發的升級版DdCBE能夠編輯A，T和C之後的C，但能夠編輯G之後C的線粒體堿基編輯器仍然缺乏。

        在這篇發表於 Nature Communications 期刊的論文中，汪陽明實驗室鑒定了多個來源於微生物中的雙鏈DNA脫氨酶(DddA)，並將其中一種改造成為線粒體堿基編輯器。

        圖1.思邈菌DddA衍生的線粒體堿基編輯器成功編輯多個線粒體基因組位點

        汪陽明實驗室米黎同學在研究伯克霍爾德菌DddA的序列和結構時，發現其羧基端存在一段序列，這些序列對於DddA的脫氨活性十分重要(圖2a)。利用這一重要信息，結合PSI-BLAST生物信息學分析手段，研究團隊在現有微生物的基因組序列中鑒定了多個與DddA同源的雙鏈脫氨酶。進一步的細致分析發現，來源於思邈菌(Simiaoa Sunni;以中國唐代“藥王”孫思邈命名)的DddA同源基因(Ddd_Ss)，具有能夠編輯A，T和G之後C的活性(圖2b)，從而有可能彌補目前線粒體堿基編輯器的缺口。

        研究團隊進一步利用Ddd_Ss構造的線粒體堿基編輯器，成功在多種細胞中實現了對14個線粒體基因組特定位點的編輯。通過引入 David Liu 等人之前發現的提高脫氨酶活性的突變，研究團隊成功構建了模擬Leber遺傳性視神經病變中的線粒體基因突變，發現這些突變會導致線粒體功能的減弱(圖2c、d)。

        圖2. DddA羧基端序列的重要性(a)，三種不同來源的DddA的序列偏好(b)，及經Dd_Ss衍生的線粒體堿基編輯器編輯後的細胞線粒體功能分析(c、d)。

        有意思的是，反過來將Ddd_Ss中一個位點(N1370)引入到伯克霍爾德菌的DddA(Ddd_Bc)時，成功提高了Ddd_Bc衍生的線粒體堿基編輯器的活性和序列兼容性。這些研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，並為未來開發新的線粒體堿基編輯器提供資源和參考。

        線粒體作為細胞的“能量工廠”，線粒體基因組(mtDNA)與人類的衰老、癌症，以及其他多種疾病有著密切關係，線粒體堿基編輯器的發明和改進，也為相關研究和疾病治療帶來了全新工具。

        該研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，但並沒有解決該領域目前廣泛存在的脫靶問題，未來需要更多更精巧的設計來實現高效和高特異性的編輯;在此之前，線粒體堿基編輯器的應用仍然會麵臨挑戰。

        北京大學未來技術學院博士生米黎和北大-清華生命科學聯合中心博士生石銘為該論文共同第一作者。北京大學未來技術學院王陽明研究員為該論文通訊作者。該研究得到了北京大學伊成器、高寧、魏文勝、程和平、王顯花和陳良怡實驗室的指導與幫助;研究由國家自然科學基金委和國家重點研發計劃“幹細胞研究與器官修複”專項資助，新發現的雙鏈脫氨酶相關應用申請專利一項。

        原始出處：

        Mi， L.， Shi， M.， Li， YX. et al. DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of mitochondrial base editing. Nat Commun 14， 874 (2023). https：//doi.org/10.1038/s41467-023-36600-2