ROS1分子亞型肺癌的研究進展

常建華

肺癌是目前惡性腫瘤死亡的首要原因，其中NSCLC 約占肺癌病例的80%。隨著分子靶向藥物研究的不斷深入，以表皮生長因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑製劑為代表的分子靶向藥物揭開了NSCLC 治療的新篇章。而隨著越來越多的肺癌相關驅動基因被發現，如ROS1、RET、K-Ras、HER2、BRAF、PI3KCA、MEK1/2、MET 等，其相應的抑製劑亦在臨床治療研究中取得一定進展。C-ROS原癌基因1酪氨酸激酶(ROSl)是受體型酪氨酸激酶，最初發現於惡性膠質瘤中，其編碼基因的重排已成為NSCLC 發生和發展的驅動基因。本文重點介紹ROS1基因重排在NSCLC發病中的作用，以及針對該靶點抑製劑的研究進展，以期為NSCLC研究和治療提供新的思路。

ROS1 融合基因的結構及功能

ROS1 基因最初是在鳥肉瘤病毒(UR2)發現的具有獨特致癌作用的基因序列。而人類ROS1基因定位於6q21染色體，屬於酪氨酸激酶胰島素受體基因，由胞內酪氨酸激酶活性區、跨膜區及胞外區3 部分組成，編碼具有酪氨酸激酶活性的嵌合蛋白。ROS1基因發生重排時丟失細胞外區域，保留跨膜區和胞內酪氨酸激酶區域，重排位點主要發生在ROS1 基因的32~36 外顯子。在NSCLC中ROS1 基因主要與SLC34A2、CD74 發生融合，並持續激活ROS1 酪氨酸激酶區及下遊JAK/STAT、PI3K/AKT、RAS/MAPK等信號通路，進而引起腫瘤的發生。

ROS1 融合基因檢測方式

目前用於檢測肺癌融合基因的常用方法主要是實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription PCR)、熒光原位雜交(FISH)和免疫組織化學(IHC)。但針對ROS1 融合基因檢測方式尚未統一。RT-PCR可明確融合型且所需組織量極少，但對組織中RNA的質量要求高，不能檢測新的未知的融合型。而FISH特異性較高，並能檢測未知融合型，但其檢測費用較高、檢測結果判讀較難。IHC具有簡便、快速、檢測成本較低等優點，但其檢測的準確性依賴於ROS1融合蛋白的表達量及相應抗體的特異性、敏感性。總之，以上3種常用的檢測方法均各有利弊，可根據實際情況及研究需要選擇合適的檢測方法。另外，隨著分子水平的基因檢測技術平台不斷發展和完善，基因檢測手段有了革命性的變化。從最初第一代以Sanger測序為代表的直接檢測技術和以連鎖分析為代表的間接測序技術，到新一代測序(NGS)的相繼出現，基因檢測技術得到了迅猛發展。NGS 技術具有通量大、時間短、精確度高和信息量豐富等優點，對於發現ROS1新融合亞型或已知基因新突變也具有重要意義。

ROS1 融合基因陽性NSCLC 患者的臨床、病理及生物特征

NSCLC中與ROS1重排的夥伴基因眾多，目前，在NSCLC患者及細胞株中已發現13個不同的ROS1 融合基因型，包括CD74、SLC34A2、GOPC、CCDC6、SDC4、TPM3、EZR、LRIG3、KDEL R2、LIMA1、MSN、CLTC 和TMEM106B。ROSl重排在NSCLC中的發生率約為1%~2%，但在EGFR/K-Ras/ALK 均陰性的人群中的發生率則可提高到5.7%。一般認為ROS1 融合基因陽性的肺癌患者，不伴有EGFR突變和(或)ALK-EML4 融合基因及K-Ras 突變，但隨著研究的深入以及實驗技術的發展，目前有少量研究發現，ROS1融合基因與其他基因共存。如rimkunas等在9例ROS1融合基因陽性的患者中，發現兩例患者伴隨EGFR(L858R)或EGFR(E746-A750del)突變。

作為肺癌驅動基因的新靶點，明確ROS1融合基因陽性人群臨床特征對指導臨床實踐有重要意義。ROS1 基因重排陽性與ALK 重排陽性的NSCLC 患者具有相似性的臨床特征，即為年輕、從不吸煙的肺腺癌患者。Bergethon 等對18例ROS1 融合基因陽性患者的年齡、性別、吸煙狀態等臨床特征進行分析，結果發現ROS1重排更多地發生於亞裔、不吸煙、女性、腺癌患者。Takeuchi 等對13 例ROS1 重排陽性患者的臨床特征進行分析，結果表明ROS1融合在年輕不吸煙患者中所占比例較高，這與Bergethon 等人的研究結果相似。在預後方麵，Bergethon 等人治療的浸潤性NSCLC 患者總生存(OS)期在ROS1重排陽性(663天)和陰性患者(607天)之間未見差別。但Lee 等報ROS1 過表達與Ⅰ期NSCLC患者較差總生存正相關。Cai等報告，在中國人群中，ROS1融合基因陰性患者比陽性患者有更長的生存期(P =0.041)。這種差異可能與各研究的人群分期不同及樣本量有關。

針對ROS1 融合基因抑製劑--克唑替尼的應用

最近的氨基酸序列分析表明，ROS1基因和ALK 基因在酪氨酸激酶區域的同源性可達49%，而在激酶催化區的ATP結合位點，二者同源性高達77%，這可能是ALK 抑製劑克唑替尼(crizotinib)在治療ROS1基因融合變異的NSCLC中取得明顯療效的共同基礎。

2010年，Kwak等最先成功報告ALK激酶抑製劑克唑替尼治療ROS1 重排變異單病例NSCLC患者。患者為31歲、不吸煙的男性多灶性細支氣管肺泡癌患者，未見EGFR突變和ALK重排。既往接受一線厄洛替尼治療，病情呈現進展，並出現呼吸困難等症狀。經額外基因檢測為ROS1重排陽性，即給予克唑替尼標準治療(250 mg，bid，po)。不到1 周，患者臨床症狀明顯改善，兩周後缺氧消失，12周時，複查胸部CT提示病灶全部消失，達到完全緩解(CR)。繼續隨訪6個月無複發跡象。2013年美國臨床腫瘤學會年會(ASCO 2013)上報告的大樣本量ROS1融合基因陽性的Ⅰ期臨床試驗數據表明，31 例ROS1 陽性晚期NSCLC 患者治療總緩解率為56%，6個月無進展生存率達到71%，證實克唑替尼在ROS1 融合基因陽性NSCLC 患者中具有良好抗腫瘤活性。

而2014 年9 月，來自美國麻省總醫院癌症中心的Shaw 教授等公布了一項克唑替尼用於ROS1 陽性的進展期的Ⅰ 期臨床試驗(NCT00585195)結果，該研究共招募了50 例ROS1基因重排的晚期NSCLC患者，其中84%的受試者之前已接受過治療。受試者每日兩次以標準劑量250 mg 口服克唑替尼，結果顯示，克唑替尼對該組患者治療高度有效。總體客觀緩解率為72%(95%置信區間58%~84%)，其中3例完全緩解，33 例部分緩解，而這些患者此前接受細胞毒化療的總緩解率尚不足10%。克唑替尼的緩解率較持久，中位緩解時間為17.6 個月，中位無進展時間為19.2 個月，其中有25 例患者尚無進展。克唑替尼的安全性與ALK 基因重排的NSCLC 是相似的。觀察到的最常見副作用為視覺障礙(82%)，腹瀉(44%)，惡心(40%)和外周性水腫(40%)。這些不良反應大多為1 或2 級。據此臨床試驗，最近美國食品與藥物管理局(FDA)已授予克唑替尼突破性藥物資格，用於ROS1 陽性NSCLC 的潛在治療。ROS1 重排為克唑替尼提供了第二個有效治療的患者亞群。

克唑替尼耐藥後的治療——第二代ALK激酶抑製劑的探索

同許多靶向藥物一樣，ROS1 陽性患者經過開始階段的克唑替尼治療敏感期後不可避免地出現獲得性耐藥。在Shaw 等進行的研究中，在數據截止時間，50 例患者中有23 例已(46%)出現疾病進展或者死亡。既往報告也研究了克唑替尼治療ROS1 陽性NSCLC的耐藥機製，大概可以分為兩類：使靶基因改變的突變或擴增基因的出現，如ROS1 激酶區域出現的G2032R;替代信號通路的激活使腫瘤細胞對ALK-信號通路失去依賴性，如EGFR 信號通路等旁路激活。

目前，第二代ALK 酪氨酸激酶抑製劑正在研製和試驗當中，2014 年，第二代ALK 激酶抑製劑ceritinib 獲美國FDA 批準，用於經克唑替尼治療後病情惡化或對克唑替尼不耐受的ALK+轉移性NSCLC 患者的治療。最近研究顯示，部分第二代ALK 抑製劑，如PF-06463922，AP26113，ASP3026 等具有抗ROS1 活性。例如，PF-06463922 是一個強效、次納摩爾級別的雙重ALK/ ROS1 抑製劑，Zou 等在體內外試驗均證實了其抗ROS1 融合基因的作用。在體外試驗裏，PF-06463922 能有效抑製克唑替尼耐藥的ROS1 G2032R 突變及ROS1 G2026M 門控基因突變。相比於克唑替尼和第二代ALK/ROS1 抑製劑certinib 和alectinib，PF-06463922顯示了更強效的抗ROS1 激酶的活性。在體內試驗中， PF-06463922 在FIG-ROS1，CD74-ROS1，CD74-ROS1 G2032R 突變的荷瘤小鼠模型中具有顯著的抗腫瘤活性。除此之外，PF-06463922 能有效的穿透血腦屏障，這將有助於對肺癌腦轉移患者的治療。目前一項關於PF-06463922 治療ALK/ROS1 突變的晚期NSCLC 患者的Ⅰ/Ⅱ 期臨床試驗(NCT01970865)正在進行中。後續需要進一步研究以確定其對克唑替尼治療後進展的ROS1陽性腫瘤是否有效。

結語

以分子分型為基礎的腫瘤靶向治療代表了腫瘤治療的最新發展方向。ROSl融合基因的發現及其抑製劑臨床活性的證實，對於指導臨床用藥、治療方案選擇，篩選靶向藥物受益人群都極有益處。但目前ROS1 融合蛋白下遊信號通路、ROS1 抑製劑耐藥機製尚未完全闡明，隻有更加深入地了解該亞型NSCLC的發生、發展機製，才能研發新的特異性ROS1酪氨酸激酶抑製劑，發展並完善肺癌的個體化治療。