基於外周血的“液態活檢”研究現狀及進展

王潔

近年來，隨著分子生物學技術的發展，基於病理形態學的腫瘤診療模式正逐漸向分子分型方向轉變，分子分型基礎上的靶向治療已成為癌症治療的重要手段之一。

無論是病理診斷亦或分子診斷，組織標本仍然是“金標準”；對於大多數無法進行手術的患者，通過活檢獲取組織標本是明確病理和分子分型的主要方式。遺憾的是，相當一部分患者無法獲得組織標本或者組織標本量過少而無法進行分子分型診斷，從而失去靶向治療的機會;另外，由於腫瘤異質性的存在，局部穿刺標本難以準確反映腫瘤的全貌，而且隨著治療選擇壓力導致的腫瘤演變以及耐藥基因的出現，僅依靠治療前組織標本指導後續治療可能會導致治療的偏倚，而是需要動態活檢、實時監測以更好地指導治療，但這在臨床實踐中難以實現。外周血含有腫瘤細胞以及遊離DNA、RNA 和蛋白，可以一定程度上反映腫瘤的特征，而且無創、易獲得，是具有前景的腫瘤組織替代品，被稱為“液態活檢”標本。

CTC

CTC研究現狀及進展

循環血流中的CTC來源於原發腫瘤或轉移病灶，其在血液中的含量波動在數個至幾千個，大約109個血細胞中含有1個CTC，分離盡可能多的CTC是針對其進行研究的關鍵前提。目前，CTC 的分離技術主要基於細胞大小(如ISET 法)和抗原抗體反應(如CellSearch法)的分離平台，以及基於微流控裝置的CTC-iChip 法。雖然CellSearch 法存在一定的缺陷，但因其檢測方法標準化、流程化且重複性較好，是目前最常用的CTC分離技術。

既往大部分研究顯示，治療前的CTC數量可以提示疾病的預後，1～2周期化療或放療後CTC數量下降提示化療或放療的無進展生存(PFS)期較長。然而，需要注意的是，這些研究定義CTC陽性或陰性的界值並不統一，受限於CTC分離技術及采集時間點的影響，所研究的CTC未必代表所有CTC的真實數量。另外，以此治療後的觀察指標來判斷療效是後知後覺。因此，基於CTC數量進行疾病預後分析及療效預測尚難以廣泛應用於臨床。

雖然CTC僅是腫瘤的一部分，但受白細胞等正常細胞的幹擾遠小於ct-DNA，因此進行基因檢測的敏感性和特異性均優於ct-DNA。

Maheswaran等采用ARMS的方法對比檢測18 例組織EGFR 突變的NSCLC患者，其中17 例在CTC 中檢測到EGFR突變(94%)，僅有7 例在血漿標本中檢測到EGFR 突變(39%)。另外，在14 例EGFR-TKI耐藥患者中，9例患者CTC被檢測T790M突變(64%)，與組織中的比例類似。

除基因突變外，基因重排也是重要分子事件，如ALK 融合基因。Pailler 等對18 例ALK 融合基因陽性的NSCLC患者CTC進行熒光原位雜交(FISH)分析(FISH陽性病例被定義為FISH陽性的CTC數目≥4個)，結果發現，均為ALK融合陽性。Attard 等在前列腺癌CTC 中也成功檢測了TMPRSS2-ERG重排，而且同時檢測了AR拷貝數變異及PTEN缺失。這些研究結果提示，基於CTC的基因突變及融合基因檢測是可行的。

然而，腫瘤是一種基因組疾病，隨著二代測序技術(Next-generation Sequencing，NGS)的發展，CTC 也進入全基因組分析時代。Kanwar 等分析了787例乳腺癌患者CTC的基因組拷貝數變異(copy number variation，CNV)，將乳腺癌分為兩個亞型(休眠型和侵襲型)。Chiu等通過分析黑色素瘤CTC 的CNV，發現CTC 的CNV 特點更接近轉移灶，且攜帶不同CNV型的預後也不同。作者所在團隊分析了小細胞肺癌(SCLC)CTC的基因組CNV模式，發現敏感性SCLC表現為MYC和RLN1的獲得，而難治性SCLC則表現為PIK3CA 和SOX2 的獲得以及FHIT 的缺失。這些基於群體CTC的研究提示，基因組CNV分析有助於進行不同個體間的亞型分類。

實際上，在同一患者體內也存在不同的亞克隆群，既往研究顯示CTC 是一群異質性的細胞群體，存在形態以及基因變異的不同，因此僅僅進行群體CTC 的分析是不夠的，單個CTC 的分析無疑可以更好地反映腫瘤的異質性並揭示轉移的機製。然而，由於單個CTC中的DNA含量極低，如何有效擴增單細胞基因組DNA則成為單個CTC 分析的主要阻礙。目前，多個研究團隊進行了單細胞水平的基因組擴增研究，主要的方法包括：退變寡核甘酸引物多聚酶鏈反應(Degenerate Oligonucleotide-Primed Polymerase Chain Reaction，DOP-PCR)法、多重置換擴增(Multiple Displacement Amplification，MDA)法以及多重退火和成環循環擴增技術(Multiple Annealing and Looping-Based Amplifications Cycles，MALBAC)法。其中，MDA法的基因覆蓋率最高，但MALBAC 法和DOP-PCR法的重複性更好，而且MALBAC法的假陽性率和錯配率更低，可見MALBAC 法是目前較為理想的一種基因組擴增方法。

作者所在團隊與哈佛大學謝曉亮團隊合作，對肺癌單個CTC進行了基因組分析，發現同一患者的不同CTC 間單核苷酸變異/ 插入缺失(SNV/InDel)存在異質性，但總體特征接近轉移灶;而不同CTC間CNV一致性較好，可以區分不同的病理類型，尤其可以鑒別可能發生病理表型轉化的人群；而且CNV不隨治療發生改變，提示CNV模式可能代表腫瘤固有的特性，因此有可能成為潛在的診斷手段。除了基因組的分析，Ting等進行了單個CTC轉錄組學的分析，發現CTC同時具有“上皮”和“間葉”來源相關基因的高轉錄，提示CTC 存在上皮間葉轉化(EMT)的過程。既往研究顯示，腫瘤轉移可能是由於CTC 發生EMT-間葉上皮轉化(MET)轉化或含有腫瘤幹細胞導致，因此結合基因組、轉錄組學以及生物信息學進行單個CTC研究極有可能為揭示腫瘤的轉移機製提供契機。

CTC作為相對完整且具有活性的細胞體不僅可用於離體的基因分析，還可作為活體模型進行藥敏試驗和新藥開發。Yu 等采用CTC-iChip 法分離乳腺癌CTC 並體外培養成穩定細胞係進行藥敏試驗，篩選出針對不同乳腺癌基因型的有效治療方案。Hodgkinson 等將SCLC的CTC直接接種小鼠建立動物模型，並驗證了這種動物模型在病理形態、基因型及治療反應方麵與原發腫瘤類似，提示了該模型的可行性。另外，由於CTC 更可能代表具有轉移潛能的一部分腫瘤細胞，因此利用CTC 基礎上的體外、體內模型開發藥物有可能成為攻克腫瘤轉移的手段。

CTC研究麵臨的問題及挑戰

CTC研究麵臨的首要問題是開發更準確、高效的分離技術。由於部分CTC在外周血中可能發生EMT轉化，因此目前常用的以上皮細胞膜抗原進行CTC 分選的CellSearch 法會漏掉這部分CTC。雖然基於可同時識別多個上皮及間葉抗原的分離技術以及其他新的分離技術如CTC-iChip等可以更有效地分離出CTC，但這些技術並未實現標準化流程，因此得出的數據在各中心的重複性會受到影響。另外，在樣本處理及分離過程中難免存在CTC 的破壞和丟失。因此，需要開發高效並且標準化、流程化的CTC分離技術，才能獲得更有意義的CTC數據。

既往研究顯示，CTC在循環血流中的存在時間約24小時，提示並非每個時間段或時間點均可有效地采集到CTC，因此標定CTC采集的時間點是高效收集CTC麵臨的另一個問題。

除此之外，提高CTC 動物模型的接種成功率以及降低CTC的分離檢測費用也是需要解決的難題。

ct-DNA

ct-DNA 研究現狀及進展

外周血中的有核細胞如白細胞等凋亡、壞死，釋放出以遊離單鏈或雙鏈形式存在的遊離DNA(Cell-free DNA，cf-DNA)，這些片段多在160～180 個堿基對之間。對於腫瘤患者而言，一部分cf-DNA 來源於腫瘤細胞，被稱為ct-DNA。然而，目前尚無有效手段明確區分ct-DNA 或非ct-DNA。外周血中既然存在ct-DNA，就可通過對ct-DNA進行基因分析來反映腫瘤的遺傳信息；而且ct-DNA反映的是腫瘤的整體特征，可在一定程度上避免腫瘤異質性帶來的局部穿刺偏倚。然而，外周血中ct-DNA的含量很低，而且被大量的正常細胞cf-DNA汙染和稀釋，因此，正常cf-DNA 含量較低的血漿相比血清更適於ct-DNA檢測。

血漿ct-DNA 的獲得操作簡單、無創，且價格低廉，相較於CTC 更可能廣泛用於臨床實踐。基於此，近年諸多研究評價了血漿ct-DNA用於驅動基因突變檢測的臨床可行性，如EGFR、K-Ras、BRAF以及PIK3CA等。其中研究最多且最可能用於臨床實踐的是EGFR突變檢測。目前多項研究結果顯示，外周血進行EGFR突變檢測，與組織標本的一致性約為59%～88%，靈敏性約為43%～82%，而特異性約為90%～100%。近期一項納入了27 項研究共3110 例NSCLC 病例的薈萃分析顯示，外周血EGFR 突變檢測的敏感性和特異性分別為62%和95.9%。重要的是，外周血ct-DNA中的EGFR突變狀態同樣可以預測EGFR-TKI的療效。這些研究結果提示外周血ct-DNA可用於EGFR突變的檢測，而且假陽性的可能性很小。

雖然，外周血EGFR突變檢測具有較好的特異性，但敏感性卻不理想，故需要更加敏感的基因檢測方法。既往的研究多采用基於PCR的方法，如測序法、ARMS 法、DHPLC 法以及PNA-CLAMP法，這些方法的檢測限為0.01%～10%，敏感性為43.1%～65.7%。近期發展起來的基於數字化PCR 平台的微滴數字PCR 法和BEAMing 數字PCR 法具有更低的檢測限(0.005%～0.01%)。Thress 等通過檢測38 例入組AZD9291 患者的EGFR 敏感突變(19del 和21L858R)以及耐藥突變(T790M)，對比分析了4種檢測方法(ARMS法、COBAS法、微滴數字PCR法以及BEAMing 數字PCR 法)在組織和血漿ct-DNA中的敏感性和特異性。對於EGFR敏感突變，COBAS法、微滴數字PCR法以及BEAMing數字PCR 法敏感性略高(86%～100%)，但三者之間差異不明顯;然而，對於T790M 突變，微滴數字PCR法和BEAMing數字PCR法具有更高的敏感性(69%～71%)，明顯高於ARMS法(29%)和COBAS 法(41%);以上結果提示數字化PCR平台具有更好的敏感性。但是，伴隨檢測敏感性的提高，特異性卻出現下降，微滴數字PCR法和BEAMing法檢測EGFR敏感突變的特異性僅為83%和67%，明顯低於ARMS 法和COBAS 法(二者均為100%)，因此尋找二者之間的平衡點即顯得尤為重要。雖然這些基於PCR的方法具有較好的臨床可應用性，但主要針對單個或幾個基因已知的突變檢測。

隨著越來越多的驅動基因的發現，僅檢測幾個基因變異是不夠的，需要建立多基因檢測平台，NGS 為此提供了機會。NGS 技術的檢測限約為0.2%～1%，可以在保證敏感性的基礎上檢測盡可能多的基因變異。Couraud 等利用NGS技術同時分析了107個血漿標本的多個基因( 包括EGFR、ERBB2、K-Ras、BRAF 以及PIK3CA)，與組織標本相比，檢測的敏感性為58%(43% ～71%)，特異性為87%(62% ～96%)。近期Lebofsky等利用NGS技術檢測了27例不同瘤種患者ct-DNA 中的46 個基因，涵蓋6800個COSMIC熱點突變，結果顯示，轉移灶中的29 個突變有28 個可以在ct-DNA 中檢測到。這些結果顯示NGS 技術用於ct-DNA 多基因突變檢測的可行性。

NGS 技術不僅可以用於檢測已知基因變異，更重要的是可以進行全基因組範圍內的基因變異分析，包括基因突變、重排以及CNV，並可以發現未知的基因變異。Murtaza等動態分析了6 例乳腺癌、卵巢癌、肺癌患者治療過程中ct-DNA的外顯子組結果，發現了可能與耐藥相關的基因變異，例如：乳腺癌紫杉醇治療過程中PI3KCA 突變率增高，鉑類治療中的RB1 突變，他莫昔芬、曲妥珠單抗治療中MED1 的突變增加，隨後拉帕替尼治療後出現的剪切變異GAS6以及肺癌EGFR-TKI 耐藥後出現的T790M 突變，以上結果提示ct-DNA外顯子組檢測可以作為組織標本的一種補充替代。Dawson 等對30例經全基因組測序發現具有點突變或結構變異的晚期乳腺癌患者治療過程中動態獲取的ct-DNA進行了深度測序，發現ct-DNA中點突變或結構變異的定量、動態檢測是更敏感的可預測療效的分子事件。另外，基於基因組學分析建立的PARE法和數字化核型分析法可以用於分析血漿ct-DNA的基因重排及染色體拷貝數變異。這些基於NGS 技術的基因組學分析無疑為外周血ct-DNA的應用敞開了通往遠方的大門。

除可簡單易行地用於基因分型外，ct-DNA另一個重要優勢是可實現基因變異的動態監測。如前所述，利用NGS技術進行ct-DNA深度測序可以實現全基因組範圍內的動態、定量基因檢測，然而目前用於臨床並不現實。

對於敏感和耐藥基因相對明確的腫瘤類型，可以通過其他的方法實現基因變異的動態、定量監測，例如EGFR 敏感突變(19del 和21L858R)和耐藥突變(T790M)。Sorenson 等對23 例接受EGFR-TKI 治療的EGFR 突變型肺腺癌患者采用COBAS的方法動態監測EGFR突變的狀態，發現EGFR敏感突變量隨著EGFR-TKI治療有效而逐漸降低，T790M含量隨著疾病進展逐漸升高，而且血漿ct-DNA中可檢測到T790M突變要早於臨床耐藥進展的344 天。Oxnard等利用微滴數字PCR 法同樣實現了基因的動態、定量檢測，該研究組檢測了EGFR突變型肺癌患者厄洛替尼治療過程中多個時間點的EGFR敏感突變(19del和21L858R)和耐藥突變(T790M)狀態，發現大部分患者EGFR突變含量與腫瘤負荷和EGFR-TKI療效相關，而且耐藥基因T790M的出現可能早於影像學進展16～32周出現。這些研究的結果提示耐藥基因可能早於影像學進展出現，那麼隨著抗耐藥基因藥物的出現，確定最佳幹預時機自然成為未來的研究課題。

ct-DNA 麵臨的問題與挑戰

目前，ct-DNA在基因檢測方麵已獲很大的進展，但在廣泛應用於臨床之前，仍存在諸多問題與挑戰。

第一，雖然大量回顧性研究顯示外周血ct-DNA進行基因檢測具有可行性，但無前瞻性研究進行驗證，因此需要開展前瞻性臨床研究才能為ct-DNA 基因檢測提供高級別的循證醫學證據，才可能改寫指南。

第二，檢測方法不統一，缺少標準化流程。從基於PCR 的技術到NGS 技術，除了ARMS 和COBAS 法，其他檢測方法並未形成標準化的流程。另外，各中心在樣本處理以及病例選擇、數據分析方麵的差異導致結果的重複性欠佳。因此，我們需要進一步標化檢測方法，盡可能減少人為因素帶來的偏倚。

第三，雖然ct-DNA 基因檢測的特異性較好，但敏感性卻不理想，如果提高敏感性，又可能導致特異性的下降。因此，選擇合適的檢測方法找到敏感性和特異性之間的平衡點是解決的辦法。

第四，利用ct-DNA進行NGS的全基因組測序相比單基因檢測平台的優勢在於可以同時進行多基因甚至基因組分析，而且可以發現未知的基因變異。這要求更大量的ct-DNA輸入量，但勢必同時帶來更多正常cf-DNA的幹擾，如果提高測序深度，又會明顯增加費用。因此，需要進一步研究如何提高ct-DNA純度(如選擇合適的采血時間點、尋找ct-DNA標定物)，以及降低全基因組檢測的費用等。

第五，由於腫瘤異質性的存在，局部組織穿刺標本很難用於基因變異的定量分析，但外周血中的ct-DNA可能反映腫瘤DNA整體水平，因此可以用於基因變異的定量分析。目前用於定量分析的方法很多，包括分光光度法、熒光染色法、實時定量PCR法及NGS技術等，但同樣是缺乏標準化的流程、缺乏統一的與臨床相關的定量數據，缺乏各定量方法間優缺點的比較，因此，基於ct-DNA的定量研究尚處於起步階段。

如何選擇CTC與ct-DNA

CTC和ct-DNA共同存在於循環血流中，均可在一定程度上反映腫瘤的生物學和基因學信息，二者在臨床和科研應用方麵各有特點，因此需要合理定位才能充分發揮二者的應用價值。

外周血最有前景的臨床應用意義是可以通過無創手段實現基因信息的動態監測，血漿ct-DNA獲取容易、操作簡單、費用低廉，而且有較好的臨床數據支持，因此在未來有可能被廣泛應用於臨床。

雖然CTC 可以提供更純的腫瘤DNA，但受分離技術及操作費用的限製，目前尚難以應用於臨床。但CTC 代表一種結構完整的細胞群體，可用於基於細胞體的形態學分析，如細胞病理學、免疫細胞化學以及熒光原位雜交等，這些技術可輔助病理診斷，而且可用於融合基因的檢測如ALK、ROS1以及才c-MET等。雖然血漿ct-DNA 也可通過實時定量PCR 實現融合基因的檢測，但是由於臨界閾值難以確定，臨床認可度較差。隨著NGS 技術的發展，通過CTC 和ct-DNA均可實現全基因組的分析，但二者均存在缺陷。利用目前技術獲得的CTC尚很難說可以代表全部的CTC，因此進行的基因組分析未必能反映整體的腫瘤基因組特點。從這一角度講，血漿ct-DNA 似乎更具優勢，但由於血漿ct-DNA 難以避免正常cf-DNA 的幹擾，導致基因組測序數據質量較差。

因此，無論CTC 或ct-DNA，基因組測序尚不十分成熟，結果的解讀也須謹慎。CTC 被認為是導致血行轉移的根源，因此是研究腫瘤轉移機製的最佳切入點。另外，CTC 作為功能性的細胞體，可以通過建立細胞係及動物接種模型進行藥敏試驗和新藥開發，而這些是血漿ct-DNA 無法完成的。總之就目前而言，血漿ct-DNA 更可能在不久的將來廣泛應用於臨床實踐，而CTC更多的是科研方麵的應用價值。

總結

“液態活檢”的概念以及其可能帶來的廣闊應用前景已經引起了世界範圍內醫學工作者的關注，基於外周血的生物信息分析和功能研究正在如火如荼地開展，近些年關於CTC 和ct-DNA的文獻發表量也相當大。但是，我們應該認識到，在這方麵依然還有諸多未知的領域，故對於任何研究的結果均應全麵考慮、謹慎判讀。未來需要臨床、科研及生物信息學專家共同合作，開展更多基於外周血的相關研究，才能使其得到更好的應用。