下一代測序（NGS）技術使快速讀取患者DNA中成千上萬的堿基序列成為了可能，NGS的快速崛起為遺傳診斷開啟了一個嶄新的時代。然而，新技術的發展也帶來了巨大的挑戰，包括技術水平、數據管理和檢測結果的解釋與谘詢三方麵帶來的挑戰。將NGS數據應用於診斷領域之前，尚且還有很多問題需要解決。

　　在這種背景下，EuroGentest和歐盟人類遺傳學會對基於NGS的遺傳病診斷進行評估和驗證，並製定了NGS診斷指南。該指南經過實驗室遺傳學家、生物信息學家、臨床遺傳學家、企業界和患者代表及其他人類遺傳領域相關人員的共同討論，最終由實驗室遺傳學家和生物信息學家製定。該指南可做為補充材料，幫助診斷實驗室有效應用NGS技術並指導NGS的資質認證。

　　該指南主要針對罕見病和單基因疾病的NGS診斷，主要專注於基因panels的靶向分析、特定的捕獲分析以及從全外顯子測序中提取可用數據。理論上或許很快就能從全基因組測序中提取類似的信息，在這種情況下，該指南將仍適用，但由於全基因組測序還能檢測到其他疾病的分子特性，因此測序深度應當相應延長。該指南涵蓋了過去幾年關於NGS的指導方針，但比舊版多了一些新見解，其中最重要的新特性是NGS診斷測試的“評價係統”。

　　該指南在三次NGS與診斷的重大討論會中生成。第一次研討會於2013年2月25日-26日在比利Leuven舉行，2013年3月7-8日在EuroGentest科學大會上NGS指南初步意見形成；第二次討論會於2013年10月1日-2日在Leuven舉行，主要對NGS診斷指南進行編寫，2013年11月21日-22日在Nijmegen敲定該指南；第三次討論會中，邀請了更多的相關人員參與，他們被邀請對指南進行評論並作評述報告，指南出版前遞交歐洲人類遺傳學董事會審核，最終該指南於2015年7月正式通過審批並刊出，並獲得了基因診斷聯盟的高度稱讚，對歐洲NGS診斷產業的質量監督有重要意義。

　　該指南從目前發展水平、診斷/臨床的效用、知情同意書及對患者和醫生的通知、驗證、報告、研究與診斷之間的區別六個方向做了38個聲明，並發表於《歐洲人類遺傳學雜誌》上。

一

目前發展水平

　　從某種意義上說，由於技術發展迅猛導致了NGS平台出現不穩定的現狀。然而，這不能作為阻止NGS應用於診斷領域的理由，因為NGS給患者帶來了潛在的利益。阻止NGS過早用於診斷的原因隻能是其質量差，未通過驗證就進入臨床診斷對患者而言具有威脅性，同時也是不可接受的。

聲明1：未根據最新指南要求進行可接受性驗證測試，NGS不應進入臨床實踐中。

　　診斷測試的目的是排除還是確認診斷應事先定義好，因為排除和確診的區別很重要，這種區別主要取決於測試的完整性和授權性，不僅僅涉及測試技術的不同設置還包括診斷的不同意見。

聲明2：實驗室必須確定即將進行的測試是用於排除診斷還是證實診斷。

二

診斷/臨床的效應

　　NGS應用於診斷領域最大的優勢是可在相對短的時間內和相對低的成本下檢測多個基因，從而得出更多的分子診斷信息。NGS的局限性在於其對平台及濃縮方法的依賴，且一直以來認為濃縮方法和測序平台容易受影響，因而額外的測試對高質量診斷來說很重要。

聲明3：測試或分析的目的和實用性必須在驗證起始時進行討論，且驗證報告中應包括摘要總結。

　　診斷的效率必須明確，因為致病變異的概率被標識了才能做出相應的分子診斷。這個概率值由病人群為單位進行計算，從臨床角度確定了NGS的性能，是反應測試效率和臨床應用的很好指標。

聲明4：當診斷實驗室考慮引進NGS監測時，首先必須考慮它的診斷效率。

　　在實踐中，診斷實驗室將提供更好的基因panels，在開發診斷測試時必須確定將一個基因移植到panels上所需的條件。在理想情況下，該問題應以多學科的方式進行一級處理，目標是編譯用於診斷的基因列表。

聲明5：出於診斷目的，隻有異常基因型和與病理相關的已知基因（發表或證實過的）才能納入分析中。

　　一直以來人們都將與身理缺陷相關基因稱為“核心基因”，從Sanger技術發展NGS技術，測序的靈敏度不應降低。例如BRCA1和BRAC2基因，Sanger測序技術結合缺失/重複分析可使靈敏度達99%，以此類推該方法對其他基因的診斷效率也應該很高。理論上增加其他基因的檢測會增加診斷率，但不應以犧牲原有的突變檢測為代價。檢出率的提高是決定核心基因檢測列表和處理缺口的關鍵因素。

聲明6：出於比對，為了避免不負責任的測試，為了患者的利益，“核心疾病基因列表”應由臨床和實驗室專家製定。

　　若不考慮本指南，實驗室可用不同參數的NGS檢測（技術和診斷）。事實上，有太多的變量無法通過固定的指南來指導檢測。因此我們為NGS檢測提出一個簡單的評分係統，該係統可公平打分並對不同實驗室提供的NGS檢測進行簡單比對。

　　A類檢測：實驗室保證編碼區和內含子區序列的可靠內參或識別變體大於99%，並用Sangger測序（或其他互補的測序分析）進行缺口填補，根據所使用的平台，選擇額外的分析，如進行均聚物延伸的分析。

　　B類檢測：實驗室能正確描述哪些區域能在可靠內參或識別變體大於99%的條件下測序，並用Sangger（或其他）測序方法進行缺口填補。

　　C類測試：C類測試僅僅基於NGS的試驗，沒有額外的Sangger（或其他）測序試驗。

聲明7：簡單的評分係統基於檢測覆蓋麵和診斷率，可對不同實驗室提供的檢測進行比較。

三

知情同意書及對患者和醫生的通知

　　基於NGS的診斷取決於實驗室所用的程序、平台、數據過濾和數據儲存。至關重要的是，谘詢醫生應當被完全告知檢測的局限性及檢測可能出現的不良影響。

聲明8：實驗室提供的每個NGS檢測應明確以下幾點：明確目標疾病，明確所檢測的基因名稱，明確可報告範圍，明確分析敏感度和特異性，如果可以，還應明確與臨床表型無關但與所檢測的基因相關的疾病。

　　NGS診斷的應用性主要依賴於直觀結果和二次結果。盡管直觀結果可從與檢測疾病相關的基因信息中獲得，但二次結果卻隱藏在與檢測疾病無關的疾病基因中。

聲明9：診斷實驗室的分析途徑應聚焦於處於調查研究中的基因pannel以避免二次結果的發生，並進行相應的驗證。

　　直觀結果在基因pannel中的概率很低，一般依賴於疾病基因。然而，檢測結果還有可能反映出隱性雜合突變，根據此還可判斷疾病的攜帶狀況。這將對後續的谘詢、生育選擇等產生影響。

聲明10：實驗室應該提供直觀結果的信息。

　　在執行NGS診斷檢測之前，臨床（遺傳）中心需要建立一個“直觀結果和二次結果的協議”，該協議必須與倫理委員會的意見相符，應明確——在實驗室、研究所或國家層麵上——除了最初的診斷結果，患者對檢測出來的額外結果的告知是否有選擇決定權，還應詳細說明檢測直觀結果與疾病攜帶狀況是否出現在檢測報告中。實驗室必須確保能妥善管理協議中的每一條選項。

聲明11：關於與目標疾病無關的其他疾病攜帶狀態和二次結果是否被告知的選項協議，如果臨床中心或實驗室決定為患者提供，那麼該協議應該包含所有的邏輯性。

　　此外，檢測前遺傳谘詢是必要的，且應包括預期結果和潛在的直觀結果與二次結果的討論，並提供足夠的信息。

聲明12：應讓患者清楚當地對直觀結果與二次結果的管理政策。

聲明13：建議給患者提供一份書麵說明書或在線可用信息說明。

四

驗證

　　樣品的質量與許多參數有關，包括數據的產量、PCR拷貝和覆蓋的比例。在診斷設置中，隻有好的樣本才是必須分析的，因此對高質量的目標基因pannel、外顯子或基因組的標準定義十分必要。

聲明14：應準確描述診斷程序中所有的NGS質量測量指標。

　　NGS技術要求監測特定的run和特定分析/樣本的特性。監測數據無需做成報告但可用於後續的驗證。

聲明15：診斷實驗室應對平台、所有的分析和所有的樣本設置一個相關質量度量結構化數據庫。

　　由於NGS工作流程非常複雜，因此應建立樣本的追蹤方法，包括在實驗室和計算分析中實施並聯法。

聲明16：在評估分析處理中包括平台驗證過程應建立樣本追蹤方法和設置樣本識別條形碼。

　　在平台驗證過程中，實驗室必須確保所有的設備和試劑都與製造商的要求相符。必須明確每種技術的局限性，並在開發測試和數據分析中將其考慮在內。實驗室必須能區分附屬於平台、特殊檢測或分析流程的特性。

聲明17：平台驗證應包括精準度和精密度，且通過驗證的平台工作結果無需其他方法來重複驗證。

　　顯然每種測序技術都存在著優缺點，生物信息學工具必須能反映這些特征。

聲明18：生物信息學流程必須針對所使用的技術平台。

　　在流程的驗證期間，診斷規範必須通過敏感和特性的分析評估。例如，SNP檢測最佳化的算法對（小片段）插入/刪除的檢測準確性不高。實驗室必須證實意識到這些特性以及所使用的變異檢測流程能滿足當前診斷分析。

聲明19：在不同的流程驗證中，必須為每種類型的變異建立敏感性和特異性分析。

　　任何化學成分的改變、濃縮方法或生物信息學分析平台應該保證後續的有效性。

聲明20：診斷實驗室必須驗證所有的生物信息學流程（公用工具或商業軟件包）的標準信息設置，以確保相關數據更改後（新版本）及時跟進。

　　包含所有相關變異的本地數據庫提供了識別特定工作平台的工件、跟蹤驗證結果、提供特異性位點數據和meta-分析交換代理（exchange proxy）的重要工具。通常這個數據庫應允許進一步注釋（假陽性、已知突變、隔離變體等），這將大大簡化診斷過程。

聲明21：診斷實驗室應使用當前注釋相關變異體的結構化數據庫。

　　數據存儲應使用標準的開放性格式如FASTQ、BAM或VCF，這些格式的數據可與其他實驗室共享。當存儲分析結果時，應額外保存完整的日誌文件。日誌文件應盡可能完整以保證FASTQ數據轉換為整個診斷報告的可複寫性。遺憾的是，關於如何存儲目前國際上還沒有共識。然而，存儲必須符合國家的需求和常識。

聲明22：診斷試驗必須對所有相關數據的長期存儲采取相應措施。

　　在啟動任何試驗之前，必須確定好臨床目標（包括編碼區和保守的剪接位點），臨床目標取決於診斷測試與所定義的基因pannel。

聲明23：可報告範圍必須在測試開發過程中確定，且對臨床醫生具有可用性（報告或傳達數字）。

聲明24：“可報告範圍”的要求取決於診斷分析的目的。

　　例如，外顯子測序分析的目的是獲得高效率的診斷，不需要進行額外分析來獲取所有基因組所覆蓋的信息，但需要與臨床醫生清晰溝通這種測試方法不能用於排除特定的臨床診斷。診斷測試必須進行準確性、靈敏性和特異性的分析評估。原則上，這些評估並不是新穎的，且被認為很麻煩，但ISO標準對其的要求十分嚴格。

聲明25：當測試發生重大變化時，必須對質量參數進行檢查，且必須重新上樣檢測。實驗室應事先定義好當測試方法更新或升級後哪種類型的樣本要重新分析及分析次數。

五

報告

　　NGS檢測結果報告的清晰性和一致性至關重要，因為實驗室的報告可能被專家和非專家閱讀。從實用的角度來看，臨床上的重要結論、相關測試和測試質量數據應寫在報告的首頁。

聲明26：NGS的分析報告應該對患者的鑒別診斷進行總結，簡要描述測試，總結結果，將主要結果放於報告首頁。

　　所有致病（5類）或可能致病（4類）的變異必須包含在報告中，由當地政策決定是否報告未分類的變異（UVs-3類），且實驗室科學家及臨床醫生必須清楚UVs-3類。

聲明27：關於基因變異報告的當地政策應由實驗室在分析之前建立和製定。

聲明28：必須收集UVs數據，最終目的是將這些變異體進行分類。

　　需發起收集和分享可用信息的群體活動，最終目的是將變異體絕對分類為致病性（5類）或良性（1類）。被實驗室或研究所采納的與直接結果和二次結果相關的政策必須體現在實驗室的實踐和報告中。

聲明29：在啟動檢測之前，實驗室應有一個關於訪問直接結果和二次結果的明確協議。

　　診斷實驗室不應該因舊數據的分析請求而超載。診斷請求應是包含合適時間與合適地點的合同，診斷試驗隻能在給定的時間提供已知的和經過驗證的信息。

聲明30：一般情況下實驗室不會係統性地重分析舊數據並生成新報告，即使與疾病相關的核心基因發生了變化。

　　但在特殊情形下（該情形由疾病的實驗室或社區專家決定，如變體類型發生變化時），實驗室有責任重新分析數據，在新證據的基礎上生成新報告，並重新聯係相關臨床醫生和患者，告知變異新狀態可能帶來的影響，這種情況下，建立病人與變異體的有效連接係統十分有必要，該係統在變異體重新分類時可對受影響病例進行檢索。

聲明31：為了管理疾病變異體，實驗室必須建立本地變量數據庫，為不同疾病的檢測提供臨床依據。

六

研究和診斷之間的區別

　　隨著全基因組測序在研究和診斷領域的可能性增加，兩者之間的界線也越來越模糊，因此描述對患者診斷數據的用途以及確定特定類型的分析研究是必要的。然而，這並不排除對診斷結果進一步研究的建議，但研究與診斷之間的區別必須時刻保持清晰。

聲明32：任何診斷測試都是為了回答與患者醫療條件相關的臨床問題。

聲明33：研究測試是一種驅動假設，結果可能僅限於參與研究的患者的臨床效應。

聲明34：通過分析外顯子或基因組得出的診斷測試結果可假設生成。

　　在診斷過程中，使用NGS技術獲得的外顯子測序和基因組數據是可以接受的，如果目標是獲得一個遺傳診斷那麼檢測將局限於與該疾病相關的已知基因。

聲明35：當以單一患者的診斷為的目的診斷檢測應在獲認可的實驗室中進行。

　　當參與一個研究項目時，患者及其家庭必須意識到這個項目可能會披露其遺傳性疾病的信息。在研究中，臨床相關的結果必須在診斷確定後才能納入患者的醫療記錄中。

聲明36：研究結果必須在通過認證的實驗室確定後方可轉移至患者身上。

　　大多數實驗室都建立本地測序/分析樣本變異頻率數據庫以便易於進行變異解釋。這類數據庫不包含任何敏感的信息。出於隱私原則考慮，不掂量這些數據對診斷和醫療改善的重要性。

聲明37：所有來自健康個體的診斷測試或研究測試的變異頻率都應共享。

　　理想情況下，疾病檢測中所有與基因相關的變體應該提交至致病性變異數據庫，並與患者的臨床數據相結合。用於變異體分類的標準和參數應清楚描述。

聲明38：所有的變異報告應提交供聯盟、地區、國家或國際數據庫共享。

　　指南英文版鏈接：Guidelines for diagnostic next-generation sequencing