終於，在克利夫蘭診所 Jeremy Rich 教授團隊的不懈努力下，一種體內篩選抗腫瘤藥物靶點的新方法誕生了!

        Rich 教授是膠質母細胞瘤領域的專家，可是對於這種侵襲性極強，中位生存期隻有 15 個月 [3]，5 年生存率在 6% 左右，被稱為「癌症之王」的癌症，他也束手無策。

        在 Rich 教授看來，這可能是研究的方法出了問題。

        「傳統藥物研發是從體外培養癌細胞開始的，然後做高通量篩選。」Rich 教授在論文中表示，「這種方法篩選出來的藥物遠遠算不上成功，在膠質母細胞瘤領域尤甚。」

        藥物研發路上的這條攔路虎，把 Rich 教授逼到了另一條道路，盡量模擬腫瘤的原生環境，然後在這種條件下篩選藥物作用靶點。

        借助於 Johannes Zuber 博士在冷泉港開發的 RNAi 技術 [1]，Rich 教授團隊開發出了一個在小鼠體內篩選藥物靶點的新技術平台。

        采用這個技術，他們找到了膠質母細胞瘤在腫瘤微環境下生存所必需的 57 個關鍵基因，讓人吃驚的是，這 57 個關鍵基因與體外培養篩選找到的基因沒有一個是重合的。當他們靶向其中一個叫 JMJD6 的基因時，超過 1 / 4 的膠質母細胞瘤模式小鼠，生存期至少延長了 67%!顯然，Rich 教授打開了癌症藥物研發的一個新方向。相關的研究成果，於 7 月 5 日刊登在《自然》上 [2]。

        腫瘤的生長環境是極其惡劣的，營養不足、空間有限，壓力山大。相較而言，生活在培養基裏麵的癌細胞就幸福多了，營養充分、條件適宜，無憂無慮、茁壯成長。在這兩種迥然不同的條件下，癌細胞所必需的生存技能顯然是不同的。靶向與腫瘤微環境有關的基因，這也是 Rich 教授想要改變研究策略的基本出發點。

        這種篩選技術的流程分為以下幾個步驟：首先，是構建短發夾 RNA(short hairpin RNA，shRNA)庫。shRNA 能夠抑製靶基因的表達。研究人員將 shRNA 整合到帶有雙重熒光報告基因的載體上 [4]。他們構建了 1586 種 shRNA，靶向 406 個已知的染色質及轉錄調節基因(每個基因對應 2 - 4 種 shRNA)。

        然後，研究人員將患者的腫瘤細胞轉移到小鼠顱腔中，保證其在腫瘤微環境中生長，並將上述 shRNA 庫轉移至腫瘤細胞中。

        之後是篩選帶有 shRNA 的腫瘤細胞。當 shRNA 成功轉移到細胞內時，會發出綠色的熒光，根據綠色熒光，就可以出篩選帶有 shRNA 的腫瘤細胞了。

        接下來是構建篩選平台：研究人員將篩選出的腫瘤細胞分為兩部分。一部分在體外培養，另一部分移植到小鼠顱腔中(體內培養)。兩種培養方式分別設立實驗組和對照組。

        研究人員給實驗組施加化學藥物，這種藥物可以讓 shRNA 表達，還會讓第二種熒光(紅色熒光)報告基因表達。這樣，活躍表達 shRNA 的腫瘤細胞就會同時發出綠色熒光和紅色熒光，同時，這種 shRNA 的靶基因的表達也會受到抑製。而對照組不予處理，對照組的腫瘤細胞隻能發出綠色熒光。

        在生長到 3 周時，研究人員將小鼠安樂死，並從小鼠顱腔取出腫瘤組織進行分離，然後再將實驗組或對照組的細胞進行測序並對 shRNA 的表達進行了量化。

        如果一種 shRNA 的靶基因對腫瘤細胞的存活是關鍵的，那麼，在實驗組中這個靶基因受到抑製後，細胞就不能存活。相對於對照組，實驗組細胞中相應 shRNA 的量也就減少。通過比較實驗組和對照組同種 shRNA 含量的變化，研究人員就可以篩選出腫瘤細胞存活的關鍵基因了。

        在比較體外培養和體內培養的篩選結果後，研究人員們震驚了：兩種培養方式中，影響腫瘤細胞存活的關鍵基因幾乎沒有重疊!在體內培養時，腫瘤細胞存活所需的 57 個基因，對體外培養的腫瘤細胞存活來說，是不重要的。

        進一步的分析發現，體外培養時腫瘤存活所需的關鍵基因多是跟細胞的代謝和大分子的合成有關，而體內培養時所需的關鍵基因多是與轉錄調節有關，而這受到腫瘤微環境的影響。

        為了找到膠質母細胞瘤的治療靶點，研究人員選擇了這 57 個基因中的 12 個與腫瘤應對環境壓力有關的基因，進行了進一步的研究。其中的一個基因 JMJD6，可以調節許多基因的表達，而這些基因對腫瘤細胞的生存是極其重要的。

        研究人員還發現，在膠質母細胞瘤患者的腫瘤中，JMJD6 基因的表達量很高，並且病情越嚴重，JMJD6 基因的表達量也越高。

        這讓研究人員很興奮，如果不讓這個基因表達，會出現怎樣的結果呢?於是他們將腫瘤細胞的 JMJD6 基因敲除，分別在體外、移植到小鼠顱腔中培養。

        這次，又得到了可喜的結果：體外培養時，敲除 JMJD6 基因對腫瘤的生長或存活並沒有什麼影響;但是，相比於沒有敲除 JMJD6 基因的腫瘤小鼠，敲除了 JMJD6 基因的腫瘤小鼠存活的時間更長了(對照組小鼠 60 天時全部死亡，超過 1 / 4 的實驗組小鼠存活時間大於 100 天)。敲除 JMJD6 基因，對體外培養(b)的腫瘤生長無影響，卻延長了小鼠的壽命。這真是太神奇了!正如本研究的第一作者 Tyler Miller 博士所說，「我們的研究結果提示，靶向腫瘤應對壓力的基因，要比靶向細胞增殖的基因，治療效果更好!這為膠質母細胞瘤的治療開辟了新的途徑!」[5]

        這種篩選方法，能夠更接近天然腫瘤環境， 針對此種方法篩選出的靶點開發的藥物，也將能給患者提供更好的療效。

        據研究人員講，這種方法也可以用於篩選其他類型癌症的潛在治療靶點 [5]。我們期待，研究人員能盡快開發出針對此類靶點的新藥物，給癌症患者帶來實際的利益!

        參考資料：

        [1] Zuber, J. et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi. Nat. Biotechnol. 29, 79–83 (2011)

        [2] Miller T E, Liau B B, Wallace L C, et al. Transcription elongation factors represent in vivo cancer dependencies in glioblastoma[J]. Nature, 2017.

        [3]http://www.abta.org/secure/glioblastoma-brochure.pdf

        [4]Zuber J, McJunkin K, Fellmann C, et al. Toolkit for evaluating genes required for proliferation and survival using tetracycline-regulated RNAi[J]. Nature biotechnology, 2011, 29(1): 79-83.

        [5]https://www.sciencedaily.com/releases/2017/07/170705151739.htm