神經外科

腦膠質瘤靶向藥物遞送係統組織結構

作者:佚名 來源:搜狐健康 日期:2017-08-12
導讀

          血腦屏障及血瘤屏障的存在,嚴重阻礙了化療藥物進入腦膠質瘤組織中發揮抗癌藥效。但近年來,隨著對腫瘤認知的深入以及實驗手段的發展,越來越多的腦膠質瘤靶向glioma targeting藥物遞送係統drug delivery system已經建立,用於提高腫瘤殺傷效果。

關鍵字:  腦膠質瘤 

        血腦屏障及血瘤屏障的存在,嚴重阻礙了化療藥物進入腦膠質瘤組織中發揮抗癌藥效。但近年來,隨著對腫瘤認知的深入以及實驗手段的發展,越來越多的腦膠質瘤靶向glioma targeting藥物遞送係統drug delivery system已經建立,用於提高腫瘤殺傷效果。基於腦膠質瘤微環境、腦膠質瘤脈管係統等特異的生理、病理特征,具有不同腦膠質瘤靶向策略的藥物遞送係統,如一級靶向、二級靶向及雙靶向等,包括腫瘤微環境響應靶向在內的其他藥物遞送係統。腦膠質瘤是顱內常見的發生於神經外胚層的惡性腫瘤,來源於星型細胞或少突膠質細胞,占顱內腫瘤的35. 26% ~ 60. 9%。根據腫瘤細胞的類型可分為星形細胞瘤、少突膠質瘤、室管膜瘤、髓母細胞瘤和多形性膠質母細胞瘤。而按世界衛生組織( WHO) 分級標準,依據腫瘤細胞具有多形性、核分裂多見、血管增生和壞死四個特征,又可將其分為4級,其中Ⅰ、Ⅱ級為低級別膠質瘤,患者平均存活時間為3 ~ 5 年; Ⅲ、Ⅳ級為高級別膠質瘤,患者平均存活時間為1 ~ 2 年。由於腦膠質瘤對腦組織具有很強的侵襲性,手術治療效果較差,且預後不佳。有資料表明,即使99. 999%的腫瘤細胞被手術切除,殘餘的0. 001%也會迅速增殖,且增殖周期僅為3 ~ 7 d。因而,術後的放化療策略對於腦膠質瘤的治療具有非常重要的意義。但是,由於腦膠質瘤相較於其他部位實體瘤滲透增強和滯留( enhanced permeabilityand retention,EPR) 效應較弱及血腦屏障( bloodbrain barrier,BBB) 的存在,即成為血瘤屏障tumor barrier。普通的化療方式很難使藥物進入腫瘤組織從而起到殺傷腫瘤細胞的作用。為了克服這樣的缺點,目前廣泛采用藥物遞送係統通過被動靶向與主動靶向將藥物有效地蓄積於腫瘤組織,從而提高療效,降低毒副作用。

        腦膠質瘤的病理特點

        腦膠質瘤具有兩個突出的組織病理學特征,即BBB 和血瘤屏障( blood-brain tumor barrier,BTB) 。一方麵BBB 阻止了98% 以上的小分子及100% 的大分子藥物滲透入腦,但同時BBB 的物質轉運機製可以保證腦內營養物質的需求,如跨細胞膜通道轉運和細胞旁路通道轉運,這種生理條件下的物質交換機製,也為腦腫瘤靶向藥物遞送係統的設計提供了必要的理論依據。此外,隨著腦膠質瘤的病情進展,新生血管不斷生成,原有的腦毛細血管也被整合到腫瘤內部,由此形成了BTB,雖然這部分血管壁上具有一定的孔徑,但其保留了BBB 的部分功能,因此對腦腫瘤靶向納米藥物遞送係統的設計提出了挑戰。

        血腦屏障

        眾所周知,BBB 是介於血液和腦組織之間的對物質通過有選擇性阻礙作用的動態界麵,由腦的連續性毛細血管內皮及其細胞間的緊密連接、完整的基膜、周細胞及星形膠質細胞腳板圍成的神經膠質膜構成。其能夠控製血漿中各種溶質選擇性的通透,把有害物質拒之腦組織之外,使其不能逸出腦毛細血管,從而保持腦組織內環境的基本穩定。因此,對於腦組織或BBB 而言,任何一種藥物均可被認為是侵害腦組織的異物,將其“拒之門外”,這就很大程度上阻礙了化療藥物進入腦部腫瘤組織,進而發揮療效。另外,就目前的臨床現狀,BBB 的存在不僅阻礙了腦腫瘤的治療,也對其診斷具有一定的消極作用。例如采用磁共振顯像技術進行腦膠質瘤的診斷,其陰性率往往較高,尤其是對於低級別的腦膠質瘤,BBB 的存在阻礙了造影劑進入腫瘤區域,不能對其有效成像。因此,BBB 作為腦部腫瘤的保護層使得腦腫瘤的治療更具挑戰性,同時,也成為了治療策略必須克服的關鍵所在。盡管BBB 嚴格控製著腦組織和血液的物質交換,但在生理條件下也具有保證腦內營養物質平衡的能力。在積極攝取腦細胞所需營養物質的同時,排泄出代謝產物和不能利用的物質。而這種生理條件下的物質交換過程,也為腦膠質瘤靶向藥物遞送係統的設計提供了必要的理論依據。目前認為,BBB 的生理結構使得其具有特殊的轉運機製,主要包括跨細胞膜通道轉運和細胞旁路通道轉運。跨細胞膜通道轉運按物質流向分類,主要包括從血液到腦的腦內攝取、進入腦內的外源性化合物從腦內向血液的外排以及從腦間質液向血液的外排。而其中與化療藥物遞送係統密切相關的,則是如何促進藥物由血液入腦。目前主要有以下幾種方式: ①載體蛋白參與的腦內攝取。這種機製對於多種小分子化合物的腦內遞送極為重要,通常將小分子藥物的結構設計為可被BBB 上表達的載體蛋白攝取,但又不被外排載體蛋白所識別。已知的相關載體蛋白較多,主要包括葡萄糖轉運體1 ( glucosetransporter 1,GLUT1) 介導的腦內己糖轉運體、L 型氨基酸轉運載體1( L-type amino acid transporter 1,LAT1) 介導的中性氨基酸轉運體、膽堿轉運體、維生素轉運體等。②受體參與的腦內攝取。這種方式是依賴於腦毛細血管內皮上表達的受體對配體的特異性識別、結合並介導其穿過細胞進入腦部的過程,具體說來,受體與配體特異性識別後,細胞膜內陷形成內化轉運小泡,從而引發細胞的內化,轉運小泡服從細胞本身對其的導向轉運,在跨細胞過程中,含有受體-配體結合物的小泡被輸送到極性內皮細胞膜的基底側,然後被釋放到細胞外。借助這條途徑,配體分子可跨越內皮細胞,進入腦內而不經過降解。腦內攝取離子、胰島素和瘦素均是通過此途徑而作用的。③吸附作用參與的腦內攝取。這種方式主要是通過帶陽離子的分子和細胞膜表麵的負電荷通過靜電力相結合而發揮作用的。該法由於缺乏特異性,可能造成其他組織的廣泛攝取增加而不被認為是藥物遞送係統設計的關鍵所在。④蛋白轉導域參與的腦內攝取。這種作用的典型代表為與人免疫缺陷病毒( human immunodeficiency virus,HIV) 相關的轉錄激活因子( tranion activator,TAT) ,但同吸附作用類似,缺乏特異靶向性。細胞旁路通道轉運由內皮細胞骨架收縮力、細胞間緊密連接和細胞外基質控製的,細胞結構的動態變化控製旁路通道的開放和關閉,所以,具有與跨細胞膜轉運大不相同的生理特征,旁路轉運大多是被動進行的,與電化學、流體力學和滲透壓梯度有關,因此,具有較高的傳送效率但較低的選擇性,另外,該轉運方式沒有轉運方向選擇性,血液向腦組織以及腦組織向血液的轉運同時存在。目前,常采取的策略是通過旁路轉運擾亂BBB,從而使BBB 穩態短時失衡、開放,從而使藥物入腦。但采用此法時務必盡可能將擾亂部位限製在BBB 周圍、時間盡可能縮短、擾亂的尺度盡可能控製在恰好能夠使藥物通過的孔徑。臨床上已有通過此方法介導藥物入腦的案例,如動脈內注射高滲溶液甘露醇,治療膠質瘤、神經外胚層瘤等; 又如緩激肽和其類似物也被用於擾亂BBB 而治療膠質瘤等。由此可見,BBB 既是藥物入腦的阻力,同時其具有的物質轉運機製也可以作為腦腫瘤特異性靶向藥物遞送係統的設計依據。

        血瘤屏障

        血管形成是維持腫瘤生長的必要條件,在腦膠質瘤中,尤其是高度惡性的膠質瘤往往富含血管並呈浸潤性生長。腦膠質瘤內的血管生成由兩方麵構成: 一是腫瘤細胞沿腦組織正常血管生長使之整合入腫瘤實質; 二是血管形成因子誘導新生血管產生。這些來源不同,但結構功能類似的微血管結構,構成了腦部腫瘤組織的BTB。膠質瘤血管微環境的結構特征是由腫瘤環境和局部宿主自身因素共同決定的。因此,與正常腦毛細血管相比腫瘤血管的內皮細胞,周細胞和基底膜明顯異常。BTB 的結構具有以下特點: ①內皮細胞增殖,胞內吞飲囊泡增多,相當一部分相互融合; ②內皮細胞間緊密連接異常短且密集,部分增寬、開放; ③周細胞增多,變大; ④毛細血管基膜呈局限性或廣泛性增厚,基板多層化,膠原纖維增生,且不連續,周圍間隙增寬; ⑤缺乏星形細胞突起形成的毛細血管基底膜鞘。所有這些腫瘤微血管組織的解剖結構特點,使得腫瘤實質的BTB 具有明顯異質性、通透性,且在惡性腫瘤的中心通常通透性更高,而那些增殖活躍、浸潤邊緣的瘤周腦組織也表現出BBB 完整性不同程度的缺陷。除此之外,膠質瘤細胞也分泌一些可溶性因子引起BBB 破壞,這些因子的確切種類尚不清楚,目前已知的包括蛋白激酶類如基質金屬蛋白酶( matrix metalloproteinase,MMP) 、血管內皮生長因子( vascular endothelial growth factor,VEGF) 和分散因子/肝細胞生長因子( scatter factor /hepatocytegrowth factor,SF /HGF) 。尤其是VEGF 在腦腫瘤中表達顯著升高,在腫瘤血管的內皮細胞上伴有VEGF 受體的表達,而正常腦組織的血管內皮卻未見表達,VEGF 與其受體結合刺激血管內皮細胞的增殖並增強血管的通透性。總的說來,BTB 與BBB相比具有較高的通透性,但由於其特殊的生理結構,在一定程度上保留了BBB 的特征。另外,與BTB 這一病理特點相關的腦膠質瘤靶向藥物遞送係統的設計也涉及另一個概念,即EPR效應———正常組織中的微血管內皮間隙致密、結構完整,大分子和脂質顆粒不易透過血管壁,而實體瘤組織中血管豐富、血管壁間隙較寬、結構完整性差,淋巴回流缺失,造成大分子類物質和脂質顆粒具有選擇性高通透性和滯留性,這種現象被稱作實體瘤組織的EPR 效應。雖然EPR 效應廣泛存在於各種實體瘤組織中,但對於腦膠質瘤,由於其存在部位的特殊性,也使得這種EPR 效應所產生的被動靶向性異於常規。具體說來,腦膠質瘤的生長最初依賴於經由腦毛細血管物質交換所供給的養分,但隨著腫瘤的增大,供給的養分已不足以滿足腫瘤生長的需求,因此會在腦腫瘤部位衍生出許多新生血管,而這些血管與其他腦部血管具有一定的相似性,血管壁上的孔徑往往較小,因此,部分保留了BBB 的特點。這樣的情況就限製了隻有小於血管壁上孔徑的粒子才可以進入腫瘤組織,進而通過EPR 效應在腫瘤部位蓄積。因此,腦膠質瘤的EPR 效應比其他部位實體瘤的弱,這也成了目前腦膠質瘤治療的一大瓶頸。

        腦膠質瘤靶向策略

        目前腦膠質瘤的靶向策略可以分為3 種: 依據EPR 效應的被動靶向,依據腫瘤表麵特異性高表達的受體作為藥物遞送係統作用靶點的一級靶向,以及在一級靶向的基礎上增加BBB 靶向的二級靶向。

        被動靶向

        與其他部位實體瘤類似,腦膠質瘤組織血管壁間隙大、完整性差、淋巴回流缺失,使得一些物質能夠通過EPR 效應直接蓄積於腫瘤部位。理論上,利用這一特點,當設計的藥物遞送係統粒徑小於腫瘤血管壁間隙孔徑時,即可在一定程度上實現藥物在腫瘤部位的有效蓄積。但由於BBB 以及BTB 的存在,使得這一被動靶向過程的優勢並沒有凸顯出來。每種實體瘤在組織病理、大小、基因型、所處微環境等方麵都有很大的區別,而能夠通過EPR 效應實現被動靶向遞送化療藥物的腦膠質瘤區域通常具有如下特點: 生長旺盛的腫瘤區域; 血管血流豐富的腫瘤區域。而後者更為重要,即血流量大,由此導致的藥物流過腫瘤組織的概率較高。但在腦部組織,一方麵,BBB 濾過了大部分的化療藥物,另一方麵,通常在腦膠質瘤邊緣部位血流豐富,而在深部組織,血流並不非常充足,因此,一定程度降低了化療藥物在

        腫瘤部位的蓄積。還有報道顯示,其他部位實體瘤的新生血管內皮間隙在100 nm ~ 2 μm 之間,而腦膠質瘤的間隙孔徑僅為100 nm 左右,這又為化療藥物的被動靶向過程增加了難度。目前,由於種種限製,單純依靠EPR 效應實現被動靶向膠質瘤的研究較少,但有報道顯示,可通過配合Ⅱ型血管緊張素提高機體循環係統血壓,從而導致腫瘤部位血流量增大,實現提高EPR 效應的目的; 另外,也有研究顯示,通過聚乙二醇( polyethylene glycol,PEG) 修飾的納米脂質體以及膠束聚合物可以避免被網狀內皮係統吞噬,進而提高其血漿半衰期,最大限度地蓄積在腫瘤部位,但是這種修飾同時也會降低腫瘤細胞對藥物的攝取。盡管EPR 效應在化療藥物遞送至腦膠質瘤方麵效果不佳,但是有人卻利用腦膠質瘤上多位點的EPR 效應差異進行血氧定量,指導氧氣缺乏引起的腫瘤耐藥的化療方案的製定。雖然BBB 與BTB 是腦膠質瘤治療的兩大障礙,但結合其組織病理學特點,目前已研究針對這一藥物遞送係統的關鍵靶點,通過設計一級靶向、二級靶向、雙靶向等藥物遞送係統,實現化療藥物的合理分布及有效蓄積。

        一級靶向

        隨著對腦膠質瘤認識的深入,目前已陸續發現了一些在腫瘤組織存在特異性表達,明顯區別於正常組織的蛋白質類標誌物,通常是一些受體,存在於腫瘤細胞、腫瘤組織內新生血管內皮細胞等的表麵。依據其設計出的配體,通常以一定的手段連接在藥物遞送係統上,當藥物遞送係統運行於體循環時,一方麵,可一定程度通過EPR 效應被動地蓄積於腫瘤組織; 另一方麵,由於配體靶向頭基的存在,可使藥物遞送係統主動識別腦膠質瘤,並被腫瘤細胞攝取,而發揮藥效。當修飾的配體頭基僅能夠識別某種膜表麵受體時,這種靶向策略常被認為是一級靶向,常見的可作為一級靶向受體的特異蛋白主要包括表皮生長因子受體( epidermal growth factor receptor,EGFR) 、MMP-2、整合素類、白細胞介素( interleukin,IL) 13 受體等,具體分述如下。

        MMP-2 MMP 是一個大家族,具有降解或分解細胞外基質的作用,因其需要Ca2 +、Zn2 + 等金屬離子作為輔助因子而得名。其家族成員都具有相似的結構,一般由5 個功能不同的結構域組成:①疏水信號肽序列; ②前肽區,主要作用是保持酶原的穩定。當該區域被外源性酶切斷後,MMP 酶原被激活; ③催化活性區,有鋅離子結合位點,對酶催化作用的發揮至關重要; ④富含脯氨酸的鉸鏈區; ⑤羧基端區,與酶的底物特異性有關。其中酶催化活性區和前肽區具有高度保守性。MMP 成員在上述結構的基礎上各有特點。各種MMP 間具有一定的底物特異性,但不是絕對的。同一種MMP 可降解多種細胞外基質成分,而某一種細胞外基質成分又可被多種MMP 降解,但不同酶的降解效率可不同。根據MMP 作用底物、分子結構可分為6 組: ①膠原酶( MMP-1、MMP-8、MMP-13) ; ②明膠酶: 明膠酶A( MMP-2) 和明膠酶B ( MMP-9) ; ③間質溶解素( MMP-3、MMP-7、MMP-10) ; ④膜型基質金屬蛋白酶( MT-MMP: MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-24、MMP-25; ⑤基質溶解酶( MMP-7、MMP-26) ; ⑥剩餘的MMP 不屬於前幾類,暫歸於其他MMP。MMP-2 基因位於人類染色體16q21,由13 個外顯子和12 個內含子所組成,結構基因總長度為27kb,與其他金屬蛋白酶不同,MMP-2 基因5' 旁側序列促進子區域含有2 個GC 盒而不是TATA 盒。作為在膠質瘤細胞表麵普遍高度表達的內肽酶,MMP-2 具有降解彈性蛋白、明膠以及標記Ⅳ、Ⅶ和Ⅹ型膠原中的螺旋區域的作用。且活化的MMP-2定位於細胞穿透基質的突出部位,估計其在酶解細胞間基質成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中起“鑽頭”的作用。有研究表明,細胞間基質這些蛋白的降解對於腦膠質瘤的侵襲轉移具有非常重要的作用,且大量的MMP-2 蛋白表達及mRNA 的定量實驗以及酶分布的考察結果顯示,MMP-2 在腦膠質瘤中確實存在過表達的現象,明顯高於正常組織的表達量。MMP-2 這種特異性的高表達即可作為腦膠質

        瘤靶向藥物遞送係統建立的關鍵。目前已有不少研究者利用其作為腫瘤靶向靶點。氯代毒素( chlorotoxin,CTX) 是一段從蠍毒裏提取出來的具有36 個氨基酸殘基的多肽,與MMP-2 具有非常高的親和力。體外免疫組化結果顯示CTX 能夠特異性、選擇性地結合於腦膠質瘤細胞,且體內放射標記CTX 示蹤結果也顯示CTX 能夠結合於原位膠質瘤移植的免疫缺陷型裸鼠的腫瘤部位。而一份關於200 例腦膠質瘤患者的病理切片報告也表明,CTX在不同惡性程度的腦膠質瘤上均有高表達,但在患者正常腦組織無分布。另外,又有間接證據表明,CTX 能夠降低MMP-2 的酶活力,且降低腦膠質瘤表麵MMP-2 的表達,而對於MMP-1、MMP-3 以及MMP-9 均無影響。CTX 與MMP-2 之間的高親和性以及MMP-2 在腦膠質瘤上的過表達,使得CTX成為了一種非常有價值的藥物遞送係統中的配體靶頭,目前有研究選用CTX 來構建基因遞送係統來靶向腦膠質瘤,將CTX 通過PEG 修飾到聚酰胺-胺型樹枝狀高分子材料( PAMAM) ,並包載Trail 治療基因,來治療腦膠質瘤,體內外實驗均得到較好結果。由於其優異的膠質瘤靶向性,CTX 還被修飾或納米探針,應用於腦膠質瘤的磁共振顯像,如將CTX 與其他小分子如131 I、Cy5. 5、三氧化二鐵納米粒共價結合,製備成不同種類的探針,再通過γ射線、單光子發射計算機斷層成像術( single-photonemission computed tomography,SPECT) 、核磁共振成像( magnetic resonance imaging,MRI) 等成像手段來判斷腫瘤的部位、大小、級別等。

        EGFR EGFR 是原癌基因C-erbB-1( HER1)的表達產物,相對分子質量為1. 7 × 105。EGFR 家族包括HER1( erbB1,EGFR) 、HER2( erbB2,NEU) 、HER3( erbB3) 及HER4( erbB4) 四個成員,均定位於細胞膜上。erbB-1 廣泛分布於除血管組織外的上皮細胞膜上; erbB-2 在正常人體腔上皮、腺上皮及胚胎中均有普遍的微弱表達; erbB-3 在除造血係統外的多數部位有表達; erbB-4 在除腎小球及周圍神經外的所有成年組織均可檢測到其表達。EGFR本身具有酪氨酶激酶活性,一旦與EGF 結合可啟動細胞核內的有關基因,從而促進細胞分裂增殖。

        研究表明,EGFR 在許多實體腫瘤中存在高表達或異常表達。EGFR 與腫瘤細胞的增殖、血管生成、腫瘤侵襲、轉移及細胞凋亡的抑製有關。其可能機製包括: EGFR 的高表達引起下遊信號轉導的增強; 突變型EGFR 受體或配體表達增加可導致EGFR的持續活化; 自分泌環的作用增強; 受體下調機製的破壞; 異常信號轉導通路的激活等。EGFR 的過表達在惡性腫瘤的演進中起重要作用,膠質細胞、腎癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌等腫瘤組織中都有EGFR 的過表達。對膠質細胞瘤的研究發現EGFR 的高表達主要與其基因擴增有關。但有時EGFR 表達水平的調節異常也存在於翻譯過程中及翻譯後。以EGFR 為靶標設計抗腫瘤藥物的相關研究已越來越多,目前,美國FDA 批準認證的具有EGFR靶向的抗腫瘤藥物主要有5 種,包括3 種小分子化合物和兩種人源的抗EGFR 的單克隆抗體,均已應用於腦膠質瘤的臨床治療分別為: ①吉非替尼,EGFR 激酶抑製劑,治療非小細胞肺癌; ②厄洛替尼,EGFR 激酶抑製劑,治療非小細胞肺癌,也可與吉西他濱合用治療胰腺癌。③拉帕替尼,EGFR/HER-2 雙靶向抑製劑,治療乳腺癌; ④帕尼單抗,人單克隆EGFR 抗體,治療大腸癌; ⑤西妥昔單抗,人單克隆EGFR 及EGFRvⅢ抗體,治療頭頸部鱗狀細胞癌和大腸癌。這些配體僅與EGFR 有較高親和力,且EGFR 在腦膠質瘤細胞上的過表達,使得這一治療方案具有較高的可行性。除西妥昔單抗外,針對腦膠質瘤受限於BTB 以及BBB 的特殊病理構造,也設計了相關藥物遞送係統,如有研究利用西妥昔單抗上的Fc 區域與樹枝狀聚乙二胺高分子材料共價結合,包載抗腫瘤藥物甲氨蝶呤,以治療腦膠質瘤; 也有報道將這種以免疫原性機製設計的脂質體材料稱為免疫脂質體,同樣將抗腫瘤藥物通過高分子材料共價連接於西妥昔單抗,靶向EGFR 高表達的腦膠質瘤,從而起到抗癌作用; 另外,也有研究利用125 I標記了柔紅黴素衍生物上的氨基-苯甲基,並將其包裹於EGF 修飾的脂質體中,放射自顯影術定位目標細胞後顯示放射標記的藥物主要集中於細胞核中,並通過與腫瘤細胞DNA 共價結合,引起DNA 雙鏈的破壞,從而導致腫瘤細胞生長抑製。

        整合素整合素是細胞黏附分子家族的重要成員之一,主要介導細胞與胞、細胞與胞外基質之間的相互黏附,並介導細胞與胞外基質之間的雙向信號轉導。整合素是由α〔( 12 ~ 1. 85) × 105〕和β〔( 90 ~ 110) × 104〕兩個亞單位形成的異二聚體。迄今已發現18 種α 亞單位和9 種β 亞單位。它們按不同的組合構成20 餘種整合素。整合素在體內表達廣泛,大多數細胞表麵都可表達一種以上的整合素,在多種生命活動中發揮關鍵作用。例如,由於整合素具有黏附作用,使其成為白細胞遊出、血小板凝集、發育過程和創傷愈合中的關鍵因素。另外,某些細胞隻有通過黏附才能使其發生增殖,若通過整合素介導的細胞與胞外基質黏附發生障礙則可導致細胞凋亡。整合素作為細胞表麵重要的受體,對腫瘤的轉化、生長、侵襲和轉移以及凋亡等過程都有非常重要的作用。整合素構象或表達的改變,會引起其與胞外基質配體的親和力發生變化,進而引起腫瘤細胞的一係列改變,包括腫瘤細胞骨架結構的解體,黏附力降低,導致細胞的惡性轉化,影響腫瘤的生長及發展; 改變腫瘤細胞與細胞間基質的黏附能力,影響其信號傳導機製,從而使腫瘤細胞的生物學行為發生改變,增強其侵襲轉移潛能; 變化的胞外基質濃度,也可影響毛細血管細胞的生長和血管的分化或退化等。而對於腦膠質瘤,整合素也有非常重要的作用。有研究表明,整合素中αvβ3 和αvβ5 兩種亞型多表達於腦膠質瘤細胞及其脈管係統中,且其表達程度與腦膠質瘤組織學惡性等級相關。尤其是αvβ3,在惡性腦膠質瘤上表達尤為明顯,有病理切片顯示,從腦膠質瘤邊緣到中心,αvβ3 均有較高水平表達。針對腦膠質瘤細胞及其新生血管內皮細胞中部

        分整合素,包括αvβ3、αvβ5 及α5β1 等的高表達特性,可以針對這樣的受體設計以其配體為靶向頭基的藥物遞送係統,從而靶向腦膠質瘤部位,起到殺傷腫瘤的作用。目前,研究最為廣泛的是西侖吉肽( cilengitide) ,即序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸( Arg-Gly-Asp,RGD) 組成,存在於多種細胞外基質中,可與11 種整合素特異性結合,能有效地促進細胞對生物材料黏附的一種五肽。西侖吉肽原本應用於胰腺癌及黑素瘤的治療,但療效不佳,意外發現其對腦膠質瘤的治療具有非常重要的意義,且目前進行的Ⅱ期臨床試驗結果也非常喜人,因此,有不少相關研究單獨或聯合用藥,或以RGD 為藥物遞送係統的靶向頭基,連接在抗腫瘤藥物遞送係統中,以達到靶向治療腦膠質瘤的作用。有研究采用環狀RGD( cRGD) 修飾的PEG-聚乳酸為膠束材料包載紫杉醇,靶向膠束抗膠質瘤細胞的能力提高了2. 5 倍,存活結果也顯示了其高效的膠質瘤靶向能力。亦有報道將cRGD 通過共價連接修飾在脂質體膜表麵來增加其細胞攝取。當然,也有利用RGD 作為膠質瘤成像係統靶頭的相關研究,如在cRGD 賴氨酸殘基連接4-18 F-苯甲酸構建示蹤劑FB-RGD,采用microPET 成像技術觀察探針在荷U87 MG 皮下瘤膠質瘤模型小鼠上成像效果,30min 時的腫瘤肌肉信號比達到5; 在荷U251 T 原位膠質瘤模型小鼠上同樣得到高信噪比的圖像,而在正常腦組織幾乎沒有FB-RGD 攝取,因此可以有效對整合素αvβ3 陽性的腦膠質瘤進行診斷。也有在三氧化二鐵納米粒表麵修飾RGD 構建磁共振造影劑IONP-RGD,可以實時監測藥物治療的療效。

        其他越來越多的研究表明,許多水解酶類如肽酶類、酯酶類、蛋白酶類均與惡性腫瘤的發生發展以及侵襲轉移等特性相關。而在這些酶類中,可以用於設計腦膠質瘤藥物遞送係統的則是肽酶類中的氨肽酶,又稱CD13、微粒體氨肽酶、氨肽酶M、丙氨酸氨肽酶、p146、p161 以及gp150 等。氨肽酶是一種Zn2 + 依賴的存在於細胞膜上的水解酶,包含967 個氨基酸,由一個短的N 端胞漿域、單跨膜域及包含了活性位點的細胞外功能域構成,能夠優先降解具有N-中性氨基酸末端的蛋白質及多肽。這種酶廣泛存在於哺乳動物細胞表麵,卻與惡性腫瘤的侵襲、轉移、分化、增殖、凋亡和血管生成等都有極大的相關性。針對氨肽酶的分布特點以及其與腫瘤的相關性,目前已設計了一些能夠特異性識別此位點從而用於腦膠質瘤靶向藥物遞送係統的配體靶頭,研究較為廣泛的則是天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸( Asn-Gly-Arg,NGR) 多肽序列。此多肽序列能夠嚴格靶向腫瘤新生血管內皮細胞,而非正常脈管組織,因此,也有人以此多肽為配體頭基治療腦膠質瘤,Zhao 等選用NGR 作為靶向腦膠質瘤血管的功能分子,介導包載紫杉醇( paclitaxel,PTX) 的PEG-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺膠束靶向腫瘤血管,通過切斷腫瘤血供來殺傷腫瘤細胞。體外細胞攝取結果顯示NGR 修飾後的膠束攝取比未修飾組提高了2. 2 倍。IL-13 是T 細胞衍生細胞因子,在人體內具有廣泛的生理作用,尤其參與了炎性反應以及免疫反應。IL-13 受體( IL-13R) 複合物由親和力相對較低的IL-13Rα1 受體和親和力相對較高的IL-13Rα2受體構成。相較於IL-13Rα1, IL-13Rα2 更適合用於藥物遞送的靶標,因為IL-13Rα2 通常不參與信號傳遞,且高表達於多形性腦膠質瘤細胞。因此, IL-13Rα2 的配體也可作為藥物遞送係統的頭基,治療腦膠質瘤。有研究采用IL-13 修飾納米載體包載多柔比星,用於多形性腦膠質瘤的靶向治療。結果顯示,靶向脂質體能夠特異性結合於膠質瘤細胞U87 和U251,而非人體正常組織細胞; 相較於遊離藥物組,靶向組能夠使多柔比星在腫瘤細胞的蓄積增加並延長藥物作用時間,從而產生更高的細胞毒性; 體內結果也顯示,靶向組能夠更好地抑製顱內腫瘤組織的生長。適配體( aptamer) 是一係列短DNA 或RNA 序列,能夠通過三維結構的對接特異地識別一些靶向蛋白,由於其具有穩定性較高、生產工藝簡單、無免疫原性等特點,因此可用作藥物遞送係統的頭基,實現靶向藥物遞送。AS1411 是一種富含鳥嘌呤的DNA 適配體,能夠與腫瘤細胞質膜表麵高表達的核仁蛋白( nuleolin) 結合,有報道采用AS1411 修飾納米粒,顯著提高了化療藥物的抗腫瘤效果。因此,適配體也可作為一種頭基,實現靶向藥物遞釋。總的說來,根據腦膠質瘤的病理特點,針對腫瘤組織上特異存在的靶標,可設計相應的藥物遞送係統,治療腦膠質瘤,將這種依賴於單一的配體-受體靶向過程稱之為一級靶向。膠質瘤一級靶向的過程首先是藥物遞送係統通過EPR 效應富集於腫瘤細胞,然後依賴配體介導的內吞作用進入腫瘤細胞,從而發揮藥效。但是膠質瘤由於其浸潤性生長特點,腫瘤邊界不明確,某些腫瘤細胞依然被BBB 包圍;此外,在膠質瘤發展早期也存在BBB,因此單一靶向策略並不適合早期膠質瘤的治療,並且對於浸潤的腫瘤細胞不能有效地清除,需要更嚴謹的設計策略來克服一級靶向不能解決的問題。

        二級靶向

        為了使得化療藥物能夠更好地殺傷腦膠質瘤細胞,需要構建既能靶向腫瘤組織,同時也能穿越BBB 的藥物遞送係統,通常,將這種雙重靶向功能稱之為二級靶向。目前對於二級靶向的研究已開始逐漸成為熱門,相關的研究方向主要包括兩個方麵:一是將具有BBB 靶向功能的蛋白或多肽作為第一級靶向功能分子,將一些已經成功應用於一級靶向的具有腫瘤細胞高親和力的配體作為第二級靶向功能分子來構建藥物遞送係統,這樣,一方麵可以通過EPR 效應進入腦膠質瘤,另一方麵可以通過腦靶向功能分子介導的跨BBB 和腫瘤高親和力配體介導的內吞作用進入腦膠質瘤; 另外,有研究報道某些受體同時在BBB 和腦膠質瘤上均存在高表達,因此可利用一個靶向功能分子同時實現雙重靶向,即雙靶向( 也是二級靶向的一種) 。目前研究較多的二級靶向藥物遞送係統包括如下幾種。

        二級靶向配體為了實現既能穿越BBB 又能靶向至腦膠質瘤細胞的目的,可同時采用兩種靶向配體修飾藥物遞送係統,以達到雙重目的。腦膠質瘤靶向配體如前所述( 一級靶向部分) ,以下介紹一些研究較為熱門的BBB 靶向配體。絕大多數營養類代謝底物如氨基酸、葡萄糖等均能通過特異的載體介導的轉運體係通過BBB,這些轉運體係同時在腦內側及腦血管側均有表達,通常橫貫於BBB。最近研究顯示,利用這種生理特性,一類結構上同促立體特異葡萄糖轉運體相似的家族———GLUT 家族可以作為BBB 靶向頭基的受體。其中,GLUT1 亞型在腦毛細血管及其脈絡叢中的表達尤其高,因此,該轉運體能夠介導與葡萄糖結構類似的化合物穿過BBB,通常,這些結構類似的化合物包括2-去氧葡萄糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖類似物等。而從藥物遞送係統設計的角度考慮,選用甘露糖作為修飾物的複合物居多,其中,對-氨苄基-α-D-甘露糖-吡喃糖苷由於其較高的特異性及親和力,應用最為廣泛。靶向配體是藥物遞送係統中的決定性因素,很多內源性配體由於其免疫原性及競爭性在使用時較為受限,因此,外源性配體引發了極大的關注。通常可采用噬菌體展示技術來表達外源性配體,噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的DNA 序列插入到噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置,使外源基因隨外殼蛋白的表達而表達,同時,外源蛋白隨噬菌體的重新組裝而展示到噬菌體表麵的生物技術。針對BBB 的特點,通過使用該技術在小鼠體內進行4 個循環的篩選,可得到由12 個氨基酸組成的短肽,即TGNYKALHPHNG( 縮寫為TGN) 。作為一種新型配體頭基,該多肽並未廣泛使用,到目前為止,僅有一篇關於使用TNG 修飾納米粒,進而證明其具有非常強的BBB 穿透能力的報道。

        雙靶向配體除了采用不同的配體靶頭修飾藥物遞送係統外,目前,一些具有血腦屏障及腦膠質瘤雙靶向的配體靶頭也可用於藥物遞送係統的設計,這樣的設計,通常使得處方的製備更加簡單易行。轉鐵蛋白( transferrin,Tf) 是一類用於轉運高鐵離子的血漿糖蛋白,相對分子質量為8 × 104。人體中,肝是產生Tf 的主要場所,而其他部位包括腦組織也一定程度的提供Tf。轉鐵蛋白能夠與細胞膜表麵的Tf 受體( transferrin receptor,TfR) 相結合,攜帶Tf 進入細胞從而維持鐵離子的穩態。正常組織以及腦膠質瘤組織中Tf 受體均有表達,且腫瘤組織中的表達明顯高於正常組織; 另外,與其他正常組織不同,腦毛細血管內皮上也存在該受體的高表達。因此,可利用Tf 修飾藥物遞送係統,從而將藥物靶向至腦膠質瘤部位,再通過受體介導的胞吞作用,將藥物遞送至細胞內,從而起到殺傷腫瘤的作用。如 上所述,受體介導的胞吞作用是藥物跨越BBB 的機製之一。在腦毛細血管側,存在大量的受體,包括轉運受體、胰島素受體、內皮生長因子受體以及低密度脂蛋白受體等。其中,低密度脂蛋白受體家族在BBB 上存在高表達,並可介導一係列具有該受體的配體結構的物質通過胞吞作用跨越BBB,如乳鐵蛋白、黑素轉鐵蛋白、受體相關蛋白等。同時,低密度脂蛋白在腦膠質瘤細胞上也存在高表達。也就是說,低密度脂蛋白也可作為藥物遞送係統的靶點,使得藥物跨越BBB 的同時,殺傷腫瘤細胞。Angiopep-2 ( TFFYGGSRGKRNNFKTEEY,2. 4 × 103 ) 作為一種低密度脂蛋白的配體,具有較高的腦穿透能力,是目前研究較為熱門的雙靶向頭基,通常采用該短肽來修飾藥物遞送係統,已達到上述雙重作用。麥胚凝集素( wheat germ agglutinin,WGA) 作為一種外源性凝集素,由於其高腦血管內皮細胞親和力以及低毒性被認為是能夠靶向並穿越BBB 的一類新型藥物遞送係統靶向頭基。有報道表明,其能夠協助病毒HIV-1( gp120) 通過BBB 而不破壞其結構功能。另外,由於腦膠質瘤細胞具有高外源凝集素凝集的現象,WGA 能夠同時靶向腦膠質瘤細胞,且相比於其他外源凝集素類,WGA 的富集能力更強。因此,可將WGA 作為BBB 及腦膠質瘤細胞的雙靶向頭基,設計藥物遞送係統 。上述二級靶向配體頭基均已應用於藥物遞送係統的設計,利用不同的特性,達到治療腦膠質瘤的目的。He 等選用Tf 作為BBB 靶向頭基,WGA 作為腫瘤靶向頭基。作者將Tf 和WAG 單獨或同時連接到樹狀高分子聚酰胺胺( PAMAM) ,利用其空腔包載多柔比星( doxorubicin,DOX) ,體外跨BBB 單層膜實驗結果顯示,2 h 後PAMAM-PEG-WGA-Tf-DOX 跨膜量為13. 5%,PAMAMPEG-WGA 為8%,PAMAM-PEG-Tf 為7%,遊離DOX 為5%。同時作者又考察了係統跨膜後對C6細胞的殺傷作用,二級靶向組的細胞存活最低。Huang 等選用多肽angiopep-2 作為BBB 和膠質瘤雙靶向頭基,構建了腦膠質瘤靶向基因遞送係統,該係統以PAMAM 作為基因載體,包載治療基因TRAIL 治療C6 細胞荷瘤模型鼠,靶向治療組模型小鼠的中位生存時間是非靶向治療組的2 倍。Xin 等 將angiopep-2 修飾於PEG-聚乙內酯( PCL) 納米粒,包載PTX,所構建的腦膠質瘤靶向遞送係統在體內外均顯示良好的效果。采用體外模擬BBB 模型考察了納米粒跨BBB 的轉運效率,孵育24 h 後PTX 組為( 4. 57 ± 0. 85 ) % ,NP-PTX 為( 7. 67 ± 1. 30 ) %,ANG-NP-PTX 為( 13. 29 ±1. 09) %。而加入遊離的angiopep-2 之後可以顯著抑製靶向納米粒的跨膜效率。Sun 等選用陽離子脂質體來共同輸送pEGFP-hTRAIL 質粒和PTX。腦切片原位末端標記檢測發現,angiopep-2 修飾組脂質體可以顯著地誘發細胞凋亡; 經4 次給藥後,angiopep-2 修飾組脂質體治療組荷U87 MG 模型小鼠中位存活時間為69. 5 d,優於陽性藥治療組47 d。所構建的雙靶向共遞藥脂質體具有顯著地抗膠質瘤活性。也有學者將外胚凝集素作為雙靶向頭基,同時利用他莫昔芬( 選擇性雌激素受體調節劑,用於治療乳腺癌,對於耐藥蛋白具有較強的抑製作用) 修飾脂質體,包裹依托泊苷,用以治療腦膠質瘤。體內外研究結果顯示,該靶向係統在C6 細胞中有明顯的富集,且能夠通過BBB 而靶向腫瘤細胞,抑製腫瘤細胞的藥物外排蛋白功能,從而起到殺傷腫瘤的作用。雖然臨床前實驗結果顯示了二級靶向的優越性,但是這類遞送係統也存在一定的不足,如係統的合成製備相對來說比較複雜,可控性差,可能會限製其在體內的應用以及向臨床的轉化; 另外,在靶向至BBB 的同時,也會一定程度破壞腦內環境的穩態,引發一些藥物安全性的隱患,可產生一定的不良反應甚至毒性。因此,這類藥物真正應用於臨床還需更加謹慎的考察和設計。

        BBB 的存在、腦膠質瘤脈管係統的低穿透性以及大腦組織的生理重要性一定程度上限製了腦膠質瘤的有效治療。但隨著對腦膠質瘤發生發展及其機製的深入認識,根據其特有的生理、病理特點合理已設計出了一係列具有較好療效的腦靶向藥物遞送係統,這些新型的納米製劑靶點不同、運用的原理不同,但卻均具有較好的體內外殺傷腫瘤效果。雖然已有的腦靶向藥物遞送係統具有較多的優勢,卻也存在著一些問題,大多數化療藥物對腫瘤細胞殺傷的同時,也會引起正常細胞的死亡,因此在構建藥物遞送係統的時候,除了增加腫瘤部位的蓄積外,另外一個目標是降低在非靶向部位的蓄積,從而降低化療藥物所產生的毒副作用。目前,對於遞送係統所應用的靶向功能分子,其相應的受體或轉運體在正常組織亦有少量表達,為了降低遞送係統在正常組織的蓄積,當其進入體循環後,靶向功能分子的靶向作用首先被屏蔽,不發揮尋靶作用,當通過EPR 效應進入腫瘤組織後,響應腫瘤微環境暴露靶向功能分子,進而發揮靶向作用。眾所周知,由於缺乏有氧呼吸,且糖酵解現象嚴重,通常腫瘤組織微環境的pH 介於6. 5 ~ 7. 0,利用這種微酸性環境,可設計環境敏感性的藥物靶向係統。當在體循環中時,由於處於中性環境,納米製劑的靶頭( 如穿膜肽TAT 等) ,收縮在內核,不發揮尋靶作用,一旦環境改變,靶頭立即伸出,靶向腫瘤細胞,而使得藥物進入腫瘤組織。通常,這種靶頭彈出的過程可根據不同的需要而設計,如多聚組氨酸鏈,在體循環的中性環境下不帶電; 而在微酸環境中,pH 小於其等電點,導致其帶正電,進而具有親水性,靶頭便隨著外部環境的改變而彈出,靶向腫瘤細胞。另外,由於腫瘤組織的生理特殊性,通常存在一些異常表達的酶類,利用這些酶的催化功能,也可設計一些酶敏感的藥物靶向係統。馬蹄形穿膜肽就是典型一例,由多聚陽離子組成的穿膜肽具正電性,可作為馬蹄結構的一條支鏈; 而由多聚陰離子組成的如多聚精氨酸具負電性,作為馬蹄結構的另一條支鏈; 同時,采用具有酶( 如MMP-2) 敏感特性的半環形多肽作為兩條支鏈的連接臂。由於兩條支鏈分別帶有正、負電性,存在相互吸引的作用,且有半環形多肽將其連接,可在體循環中形成一個屏蔽的馬蹄形結構,不發揮靶向作用。當循環至腫瘤組織處,由於半環形多肽具有MMP-2 酶敏感性,該連接點被切斷,正、負電荷相吸的平衡被破壞,導致穿膜肽釋放,載藥的穿膜肽隨即快速進入腫瘤組織,進而發揮藥效。雖然環境敏感的藥物靶向係統還未應用於腦組織腫瘤的治療中,但這必將是抗腫瘤靶向藥物遞送係統設計的一大趨勢,尤其是由於腦組織的生理重要性,這種能夠盡可能避免毒副作用的設計理念將更具前景。總之,隨著對腫瘤的不斷認知以及新技術的不斷發展,更具臨床意義的新型腦膠質瘤靶向藥物遞送係統將被不斷開發,對腦膠質瘤的治療起到巨大的推動作用。

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