中國學者在ADA舞台上傳遞的“中國之聲”亦是大會看點之一。下麵讓我們先來看看來自中山大學附屬第三醫院曾文博士代表曾龍驛教授團隊分享的“Caveolin-1沉默改善高脂誘導的胰島β細胞凋亡和功能障礙”報告。

摘要

中山大學附屬第三醫院曾文博士

脂毒性導致的胰島素分泌功能障礙是2型糖尿病發病的重要原因之一。因此，保護胰腺β細胞的數目和功能是糖尿病研究的長期目標。以往研究表明，膜蛋白中小凹蛋白1(Caveolin-1)與β細胞凋亡和胰島素分泌有關，但其中機製仍不清楚。本研究的目的是探討Cav-1沉默是否保護脂毒性下的胰腺β細胞及潛在機製。我們研究發現，Caveolin-1(Cav-1)沉默可以顯著促進β細胞增殖，抑製棕櫚酸酯(PA)誘導的胰腺β細胞凋亡並增強胰島素的產生和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)。這些作用與其激活Akt和ERK1/2、抑製細胞周期抑製分子(FOXO1，GSK3β，P21，P27和P53)的表達並促進Cyclin D2和Cyclin D3的表達有關。隨後，通過抑製PI3K/Akt和ERK/MAPK信號通路阻斷了Cav-1沉默對β細胞數目的保護作用。而且，PA可以誘導內質網(ER)應激，但Cav-1沉默後顯著降低了eIF2α磷酸化和ER應激反應標誌物BiP和CHOP的表達，而這些標誌物可以增強細胞對脂毒性的敏感性。此外，通過電鏡觀察到Cav-1沉默改善了脂毒性下的自噬功能障礙，這個現象與其引起Lc3b mRNA、LC3-II和LC3-II/LC3-I蛋白的表達上調、p62表達下調以及mTOR通路被抑製的結果相一致。我們的研究結果表明，Cav-1沉默可以降低脂毒性誘導的β細胞凋亡和改善胰島素分泌功能障礙。因此，Cav-1可能作為未來T2DM治療中潛在的靶點。

專家點評

中山大學附屬第三醫院曾龍驛教授

關鍵點1:Cav-1沉默促進了胰島β細胞的增殖和胰島素產生

為了確定Cav-1沉默是否影響NIT-1細胞和小鼠胰島細胞的增殖，我們進行了ki-67免疫熒光染色實驗。結果顯示，PA的處理顯著抑製了NIT-1細胞和小鼠胰島細胞增殖，而不管有或沒有0.5mM的PA處理，沉默Cav-1均可促進NIT-1細胞和胰島細胞的增殖。同時，PA處理抑製了NIT-1細胞和胰島中Cyclin D2和Cyclin D3的表達水平。而沉默Cav-1後，無論有否PA處理，NIT-1細胞和胰島中的Cyclin D2和Cyclin D3的表達顯著增加。以上這些結果表明，沉默Cav-1的的NIT-1細胞和胰島均具有更高的增殖活性。由於正常的小鼠胰島增殖效率非常低，所以Cav-1沉默誘導的β細胞增殖有一定的價值。

研究表明，長期暴露在PA環境下可以導致胰腺β細胞功能障礙。我們隨後研究了Cav-1沉默在胰島素分泌中的作用。結果表明，無論有否PA處理，Cav-1沉默組與對照組相比，胰島素mRNA表達和胰島總胰島素含量升高均超過2-3倍。

關鍵點2:Cav-1沉默抑製了PA誘導的胰島β細胞的GSIS功能失調和凋亡

此外，我們發現PA處理可以增加基礎條件下的胰島素分泌，但對16.7mM葡萄糖刺激無反應，說明PA處理引起了GSIS功能障礙，胰島對葡萄糖濃度的變化敏感性下降。但是，Cav-1沉默成功逆轉了PA引起的高濃度葡萄糖刺激下的胰島素分泌功能障礙，並且在GSIS測定中仍然保持了2倍以上的胰島素分泌增加量。總之，這些結果表明Cav-1沉默可以改善PA刺激下的胰島的胰島素分泌功能障礙。

另外，通過流式細胞術分析發現，PA處理可以顯著增加NIT-1細胞凋亡，而敲除Cav-1後，細胞凋亡明顯減少。同樣的結果也在Hoechst 33342/PI染色法和TUNEL染色法中被證實。此外，PA處理引起的caspase3剪切體的增加也被Cav-1沉默顯著抑製。這些結果表明，Cav-1沉默可以抑製PA誘導的胰腺β細胞凋亡。

為了研究Cav-1沉默促進β細胞增殖、胰島素分泌和抑製其凋亡的潛在機製，我們檢測了Cav-1沉默後PI3K/Akt、ERK/MAPK通路以及細胞周期抑製蛋白在有或沒有PA處理下的變化。結果表明，Cav-1沉默顯著促進了PA刺激下的Akt和ERK的磷酸化。隨後，我們通過相應通路的抑製劑來阻斷Akt和ERK1/2磷酸化則消除了Cav-1沉默對β細胞的促增殖活性。且PA刺激促進了細胞周期抑製子(FOXO1，GSK-3β，P21，P27和P53)的表達，而Cav-1沉默顯著抑製了細胞周期抑製子的表達。這些結果均表明，Cav-1沉默通過調控PI3K/Akt、ERK/MAPK通路和細胞周期相關蛋白，促進β細胞增殖，降低PA誘導的凋亡。

關鍵點3:Cav-1沉默降低了PA誘導的胰島β細胞內質網應激

研究表明，內質網應激可以導致胰腺β細胞功能障礙和細胞凋亡。因此，我們研究了在有或沒有PA處理的情況下，Cav-1沉默和ER應激的關係。通過對ER應激標記分子(BiP，XBP-1s，ATF4和CHOP)表達和eIF2α磷酸化的分析，我們發現PA處理激活了NIT-1細胞和原代胰島中ER應激信號轉導，顯著上調了NIT-1細胞和胰島中的ER應激標記分子的表達，並且促進了NIT-1細胞的eIF2α的磷酸化。但是，Cav-1沉默顯著降低ER應激標記分子和eIF2α的磷酸化。這些數據表明，Cav-1沉默減輕了PA誘導的內質網應激，這可能參與了其保護胰腺β-細胞功能障礙和細胞凋亡的作用。

關鍵點4:Cav-1沉默改善了PA誘導的胰島β細胞自噬功能障礙

自噬缺陷與胰腺β細胞的數量減少和功能障礙有關。我們的電鏡結果顯示，0.25 mM的PA刺激下的NIT-1表現為自噬小體增加，溶酶體和自噬溶酶體缺如，自噬功能失調。高脂刺激下，沉默Cav-1的NIT-1細胞與對照組比較，溶酶體正常，且自噬小體與自噬溶酶體均正常形成，自噬調控過程正常。

進一步對調控自噬的關鍵分子的研究結果發現，PA可以引起NIT-1細胞株和原代胰島的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的蛋白水平顯著上調。但PA刺激同時引起了自噬後期底物p62降解障礙，表現為NIT-1細胞株和原代胰島中自噬底物p62分子累積，說明PA刺激下，自噬後期出現了功能障礙，不能正常完成自噬-溶酶體過程以降解有毒物質。另一方麵，調控自噬的關鍵信號通路mTOR，在PA刺激下被顯著促進，導致下遊Beclin-1轉錄水平下調，從而影響自噬調控。而沉默Cav-1則表現為更高水平的Lc3b、LC3-II和LC3II/I的表達水平。且PA誘導的自噬失調被有效控製，p62的累積在基因和蛋白水平均被顯著下調，說明自噬後期的功能障礙被改善。而PA引起的mTOR信號通路的激活也被有效抑製，引起下遊Beclin-1的轉錄水平上調，自噬被促進。總之，Cav-1沉默改善了PA刺激下的胰腺β細胞自噬功能障礙。