在一項新的研究中，來自美國哈佛醫學院和波士頓兒童醫院的研究人員利用一種新的基因編輯方法挽救了患有遺傳性聽力喪失的小鼠的聽力，而且在成功地做到這一點的同時沒有產生任何明顯的脫靶效應。這些被稱為貝多芬小鼠(Beethoven mice)的動物因為具有相同的導致人類進行性聽力喪失(progressive hearing loss)並且最終在20歲左右耳聾的基因突變而接受了這種方法的治療。相關研究結果於2019年7月3日在線發表在Nature Medicine期刊上，論文標題為“Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss”。

這種新的方法涉及經典的CRISPR-Cas9基因編輯係統的一種優化的更加精確的版本，能夠更好地識別在貝多芬小鼠中發現的這種引起疾病的基因突變。這種精確的工具允許科學家們選擇性地讓一個稱為Tmc1的聽力基因的缺陷拷貝失活，同時讓它的健康拷貝發揮功能。值得注意的是，這些研究人員報道，他們的係統成功地在小鼠基因組的30億個堿基中識別出Tmc1基因缺陷拷貝中單個錯誤的DNA堿基。

這些研究人員提醒說，即使是像這樣的高精度基因編輯療法在可用於人體之前，還有許多研究工作要做。不過，他們說，這項研究代表了一個裏程碑，這是因為它極大地提高了標準基因編輯技術的功效和安全性。

哈佛醫學院布拉瓦特尼克研究所轉化醫學科學教授David Corey說道，“我們的研究結果證實目前經典的CRISPR/Cas9編輯工具的這種更精確、靶向性更好的版本實現了前所未有的識別水平和準確性。”

此外，Corey及其團隊表示，這些研究結果為使用相同的精確方法治療由基因的單個缺陷拷貝引起的其他顯性遺傳的遺傳疾病奠定了基礎。

每個人都繼承了同一個基因的兩個拷貝---一個拷貝來自父親，另一個拷貝來自母親。在許多情況下，一個正常的基因足以確保正常的功能，讓人體免於疾病。相反，在所謂的顯性遺傳性遺傳疾病中，一個基因的單個缺陷拷貝就能夠導致疾病。

論文通訊作者、哈佛醫學院耳鼻喉科與神經病學教授Jeffrey Holt說道，“我們相信，我們的研究為一種治療一係列由基因的單個缺陷拷貝引起的遺傳疾病的超定向方法打開了一扇大門。這真地是精準醫療。”

攜帶有缺陷性Tmc1基因的小鼠被稱為貝多芬小鼠，這是因為它們的疾病過程模擬了德國著名作曲家路德維希-範-貝多芬所經曆的進行性聽力損失。不過，貝多芬耳聾的原因仍然是一個猜測的問題。

在貝多芬小鼠中，它們存在的標誌性缺陷是Tmc1基因的DNA序列中存在一個不正確的堿基---堿基A替換堿基T，即單個堿基錯誤表示著正常聽力和耳聾之間的差異。

讓Tmc1基因的突變拷貝失去功能或沉默足以保護貝多芬小鼠的聽力，但是這如何在不會無意中讓健康的基因拷貝失去功能的情況下完成呢?

雙重識別

經典的CRISPR-Cas9基因編輯係統通過使用向導RNA(gRNA)來識別發生突變的靶DNA序列。一旦確定了靶DNA的位置，切割酶Cas9就會進行切割。

到目前為止，這些基因編輯器的準確度並不完美。這是因為引導酶Cas9到達靶位點的gRNA和切割靶DNA的酶Cas9並不完全精確，最終可能會切割錯誤的DNA位點。

為了克服這些挑戰，這些研究人員采用了對最初由哈佛醫學院病理學教授Keith Joung和哈佛醫學院病理學助理教授Ben Kleinstiver開發的一種工具進行了改進，其中這種工具使用源自金黃色葡萄球菌的一種經過修飾的Cas9酶，而不是來自釀膿鏈球菌的標準Cas9。

為了提高檢測和破壞的準確性，這種新的優化係統將兩個層次的識別結合在一起---gRNA用於確定靶基因的位置和Cas9的一種修飾形式用於精確定位貝多芬小鼠中的特定DNA突變所在的位置。使用這種兩種形式的識別可確保精確地和選擇性地切割基因Tmc1的異常拷貝，而不影響它的健康拷貝。

論文第一作者Bence Gyorgy說道，“我們利用了這個係統識別突變DNA而非正常DNA的事實，並使用雙重識別係統來提高精確度。這種方法在靶向突變基因方麵產生了前所未有的特異性。”

在對具有和不具有這種貝多芬突變的細胞開展的一組初始實驗中，這種工具準確地區分Tmc1基因的兩個拷貝中的突變DNA和正常DNA。進一步分析顯示，在含有這個基因的一個缺陷拷貝和一個正常拷貝的貝多芬細胞中，至少99%的分子“切割”僅發生在這個基因的缺陷拷貝中。

接下來，這些研究人員將這種基因編輯工具注射到含有或沒有這種貝多芬突變的小鼠內耳中。DNA分析顯示編輯活性僅發生在具有貝多芬突變的小鼠的內耳細胞中。在接受這種注射的沒有這種突變的小鼠的內耳細胞中沒有檢測到編輯變化---這一發現證實了這種工具的精確度。

為了確定這種基因編輯療法是否幹擾了正常的基因功能，這些研究人員以沒有攜帶貝多芬突變的小鼠為實驗對象，刺激了來自這些接受這種治療的小鼠的聽力細胞(稱為毛細胞)。這些細胞顯示出不變的正常聽力反應，從而證實這種基因編輯療法對正常基因功能沒有影響。

沉默貝多芬突變

為了測量這種基因編輯療法是否在動物體內而不僅僅是在細胞中起作用，這些研究人員進行了金標準的聽力測試。他們測量了這些小鼠的聽覺腦幹反應，以便捕捉了內耳毛細胞檢測到多少聲音並傳遞到大腦中。

如果不進行治療，貝多芬小鼠通常在6個月大時就完全失聰。相比之下，沒有這種遺傳缺陷的小鼠在整個生命過程中都能保持正常的聽力，並且可以檢測到大約30分貝的聲音(相當於耳語的聲音水平)。

在接受這種基因編輯治療兩個月後，貝多芬小鼠的表現明顯好於未治療的攜帶這種基因突變的貝多芬小鼠。這些經過治療的小鼠能夠檢測到約45分貝的聲音(相當於正常談話的聲音水平)。聽力保持最大的貝多芬鼠標能夠聽到25至30分貝的聲音，幾乎與健康的同齡小鼠無法區分。

總之，這些研究結果證實這種新的基因療法有效地讓Tmc1基因的缺陷拷貝沉默，並挽救了貝多芬小鼠的聽力，使得它們免於在這種疾病中經常出現的快速死亡。

鑒於這種疾病以進行性聽力喪失為特征，這些研究人員評估了這種治療在數月內對疾病進展的影響。他們在小鼠出生後不久就提供這種治療，並且每4周在接受治療和未接受治療的攜帶和未攜帶這種突變的小鼠中進行聽力測試，持續長達6個月。

在第一個月，未經治療的貝多芬小鼠能夠聽到低頻聲音但在高頻時聽力明顯下降。到出生後6個月時，未經治療的貝多芬小鼠失去了所有的聽力。相比之下，經過治療的貝多芬小鼠在低頻時保持接近正常的聽力，而且其中的一些甚至在高頻率下仍顯示接近正常的聽力。

值得注意的是，經過治療的沒有攜帶這種貝多芬突變的小鼠沒有因為這種基因治療而出現任何聽力損失---這一發現證實了這種治療方法的安全性及其選擇性靶向這個基因的異常拷貝的能力。更令人鼓舞的是，在接下來近一年的時間裏，一小部分經過治療的貝多芬小鼠保持穩定的接近正常的聽力。

鑒於貝多芬突變的特點是內耳中聽力細胞的逐漸惡化和死亡，這些研究人員使用電子顯微鏡可視化觀察這些至關重要的聽力細胞的結構。正如預期的那樣，在未經治療的貝多芬小鼠中，他們發現聽力細胞逐漸喪失，它們的結構也逐漸惡化。相比之下，經過治療的貝多芬小鼠和經過治療的健康小鼠都保留了正常數量的具有完整或接近完整結構的聽力細胞。

在最後的實驗中，這些研究人員在一係列攜帶貝多芬突變的人體細胞中測試了這種治療的效果。DNA分析顯示這種治療僅在Tmc1基因的突變拷貝中進行編輯，而正常的拷貝不受影響。

鑒於這種方法能夠靶向單點基因突變，它也有望治療15種其他形式的也由其他聽力基因的DNA序列中的單堿基突變引起的遺傳性耳聾。

此外，這些研究人員表示，他們的技術可能適用於由單點突變引起的其他顯性遺傳性遺傳疾病。為了確定它的潛在用途，他們掃描了聯邦ClinVar數據庫---一個與人類疾病相關的所有已知基因突變的國家信息庫。分析結果表明基於這種工具的特異性，它能夠正確識別3759個缺陷的基因變異，這些基因變異總共導致五分之一的顯性人類基因突變。

Holt說道，“毫無疑問，這是萬裏長征的第一步。但是我們在這項研究中的原理論證表明這種高度特異性、高度靶向的治療方法經開發出來後能夠選擇性地抑製攜帶單點突變的基因，並有可能治療許多其他形式的人類疾病。”