1.甲基化的概念

　　甲基化是指在底物中添加甲基集團的反應，包括DNA甲基化和蛋白質甲基化。哺乳動物DNA甲基化主要發生在CpG位點，使胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶。通常，甲基化修飾會幹擾轉錄因子與基因的結合或者招募甲基DNA結合蛋白等形成轉錄抑製複合物，抑製基因啟動子的活性。但在某些情況下，DNA甲基化也能激活基因的轉錄3。DNA甲基化修飾由DNA甲基轉移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs)催化完成，相對較穩定，但並非不可逆轉。

　　哺乳動物DNMTs主要包括三種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b,其中DNMT1主要參與甲基化狀態的維持，後兩者則與新的甲基化形成相關。蛋白質的甲基化修飾發生在蛋白質的精氨酸或賴氨酸殘基上，分別由蛋白精氨酸甲基轉移酶和賴氨酸甲基轉移酶催化完成。其中，研究最多的是組蛋白甲基化修飾，即將甲基由&腺苷甲硫氨酸轉移至組蛋白上。組蛋白甲基化修飾的具體作用取決於甲基化位點。

　　組蛋白H3的賴氨酸9或27位點的甲基化(H3K9或H3K27)和組蛋白H4的賴氨酸20位點的甲基化(H4K20)多為轉錄抑製調控，而組蛋白H3賴氨酸4、36和79位點(H3K4、H3K36和H3K79)的甲基化則多與轉錄激活相關。DNA甲基化和組蛋白甲基化修飾均屬於表觀遺傳學的重要組成部分，在轉錄和翻譯水平調控基因表達。

　　 2.甲基化修飾參與神經病理性疼痛的調控

　　DNA甲基化與神經病理性疼痛神經病理性疼痛研究的一大難題是機製的複雜性，神經通路中任何環節的異常均有可能導致神經病理性疼痛的發生。目前研究認為大腦、脊髓和背根神經節(dorsalrootganglia,DRG)內疼痛相關分子的改變在神經病理性疼痛中發揮關鍵作用。

　　DRG是聯係外界環境刺激與中樞神經係統的樞紐。Pollema-Mays等首次探討了成年大鼠DRG內三種DN-MTs在疼痛中的變化。與假手術組比較，部分坐骨神經損傷(sparednerveinjury，SNI)大鼠術後三種DNMTs表達上調，但持續時間不同;DNMT3b術後1周即明顯升高，持續至觀察結束(術後4周)，而DNMT3a和DNMT1的表達增加持續時間較短且程度較輕，術後2周消失。這提示外周神經損傷引起的神經病理性疼痛中，DRG內不同DNMTs發揮的作用可能不同，但其具體機製仍待進一步研究。除外周神經損傷外，腫瘤也是引起神經病理性疼痛的重要原因。

　　Zhou等在癌性痛模型中發現腫瘤細胞注射不僅可使大鼠產生痛敏現象，同時腰段DRG內嘿呤受體(purinergicreceptor,P2X3R)和核因子(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)亞基p65的表達明顯升高，進一步研究表明DRG內DNMT3a和3b減少，p65與P2X3R基因結合增加。因此推測DNMT3a和DNMT3b減少導致P2X3R基因啟動子區甲基化水平降低，去甲基化的P2X3R基因有利於p65的結合，進而促進P2X3R高表達。

　　類似的，Zhang等對大鼠糖尿病神經病理性疼痛模型的研究表明，支配後爪的DRG內DNMT3b表達明顯降低，P2X3R基因啟動子區CpG島去甲基化，p65與P2X3R基因結合活性增強，引起DRG內P2X3R的高表達，參與糖尿病神經病理性疼痛的病理過程，阻斷p65信號通路則能夠緩解大鼠的痛敏症狀。由此可知DRG內DNA甲基化修飾參與神經病理性疼痛的調控，但不同模型的誘發因素不同，機製可能不同，DNMTs的表達也有所不同。

　　神經病理性疼痛的另一個難題是阿片類藥物的鎮痛效果減弱。目前阿片類藥物仍是應用最廣的治療神經病理性疼痛的藥物，但長期應用不僅效果減弱，甚至可能產生嚴重的不良反應。Zhou等研究表明這可能與神經損傷引起的DRG內μ阿片受體(muopioidreceptor，MOR)下調有關，神經損傷可引起MOR基因近端啟動子區甲基化水平升高，而給予DNA甲基化抑製劑後，DRG內MOR的表達升高，嗎啡的鎮痛效果也明顯改善。這提示DNA甲基化抑製劑有望成為治療神經病理性疼痛的輔助藥物。

　　DRG接受外界環境刺激後，將信號轉換並上傳至脊髓或高級中樞進行信息整合。因此，脊髓也是神經病理性疼痛的重要調控位點。研究表明慢性坐骨神經壓迫性損傷(chronicconstrictioninjury,CCI)後大鼠腰段脊髓背角穀氨酸脫羧酶(glutamatedecarboxylase67,GAD67)的表達明顯減少。

　　GAD67作為抑製性遞質GABA合成的關鍵酶，其減少引起GABA抑製性作用減弱，參與神經病理性疼痛的形成。進一步研究表明GAD67基因啟動子區甲基化水平升高，同時脊髓內DNMT3a、DNMT3b、甲基CpG結合蛋白2(methyl-CpGbindingprotein2,MeCP2)表達升高，而甲基DNA結合域蛋白2(methylatedDNAbindingdomain,MBD2)含量下降。這提示外周神經損傷引起脊髓內GAD67的下調可能與DNMT3a、DNMT3b、MeCP2以及MBD2介導的GAD67基因啟動子區DNA甲基化水平升高有關。

　　近年來，研究表明Wnt/fhcatenin信號通路也參與神經病理性疼痛的發生過程。Feng等研究表明CCI術後同側脊髓背角內Wnt3a表達升高，同時Wnt3a基因啟動子區組蛋白H3乙酰化水平升高，胞嘧啶甲基化水平降低，提示組蛋白修飾和DNA甲基化共同調控基因表達。類似的，Wang等研究表明外周神經損傷後動物脊髓內總DNA甲基化水平以及MeCP2的表達明顯升高，應用DNA甲基轉移酶抑製劑後，脊髓內總的DNA甲基化水平和MeCP2的表達下降，同時神經損傷引起的動物痛覺敏感等症狀也得到緩解。由此可知，脊髓內DNA甲基化修飾參與神經病理性疼痛的調控。

　　腦內前額葉皮質(prefrontalcortex，PFC)是調控疼痛的重要區域。Tajerian等研究表明坐骨神經分支損傷術後6個月，小鼠出現感覺異常和焦慮情緒，PFC和杏仁核內總DNA甲基化水平明顯下降。而且，PFC內總DNA甲基化水平與動物痛敏症狀的嚴重程度顯著相關。通過環境富集化運動(environmentalenrichment)緩解神經損傷引起的動物痛敏症狀後，PFC內總甲基化水平也有所回升。這提示DNA的甲基化可能是神經病理性疼痛與焦慮情緒的共同作用機製。實際上，大腦作為複雜的高級中樞，相關區域DNA甲基化參與多種生理過程。

　　Zhong等進一步探討了神經病理性疼痛的親代是否會對子代產生影響，研究顯示神經病理性疼痛的母鼠普遍出現親代照護缺陷，其喂養的子代表現出明顯的焦慮情緒和行為，子代室上核後葉催產素表達下降，杏仁核內DNMT1高表達且總甲基化水平也明顯升高。這提示腦內DNA甲基化不僅參與神經病理性疼痛的調控，也會對子代產生不良影響，但其具體機製尚未明確。

　　組蛋白的甲基化修飾與神經病理性疼痛組蛋白的甲基化修飾在神經病理性疼痛中同樣發揮重要作用。Laumet等研究表明神經損傷後受損DRG內組蛋白賴氨酸N甲基轉移酶2(G9a)的表達明顯升高，同時多種膜電位相關鉀離子通道基因啟動子區H3K9me2水平升高，選擇性基因敲除DRG內G9a的表達，不僅恢複了神經損傷引起的鉀通道下調，也阻止了神經病理性疼痛的產生。進一步研究顯示抑製DRG內G9a的表達也可影響神經損傷引起的許多其他基因的表達，MOR就是其中之一。研究顯示神經損傷後受損DRG內MOR表達下調，其基因啟動子區H3K9me2的含量增多，阿片類藥物鎮痛效果減弱;抑製或者敲減DRG內G9a的表達能夠逆轉MOR的下調並增強嗎啡的鎮痛效果;基因敲除DRG內G9a編碼基因則能夠阻止神經損傷所造成的上述改變。這提示DRG內G9a通過組蛋白甲基化修飾在神經病理性疼痛的形成和治療中均發揮關鍵作用。

　　除G9a外，SUV39H1也是一種重要的組蛋白甲基轉移酶，主要催化H3K9me3的形成。Zhang等研究表明脊神經結紮(spinalnerveligation，SNL)後受損DRG和同側L5脊髓背角內SUV39H1的表達明顯升高，阻斷或敲減SUV39H1的表達能夠緩解SNL引起的痛敏症狀，這提示SUV39H1參與神經病理性疼痛的調控。但DRG和脊髓內SUV39H1的表達和作用機製不完全相同。DRG內SUV39H1的蛋白和mRNA均升高，提示轉錄和翻譯水平均被激活，其參與調控神經病理性疼痛的機製與神經損傷引起的MOR的下調和脊髓中樞敏化有關;而脊髓內SUV39H1僅在翻譯水平被激活，mRNA含量無明顯變化，具體作用機製尚未明確。由此可知，組蛋白甲基化修飾可以在不同水平參與神經病理性疼痛，同一種受體也可由多種甲基化修飾酶來調控，而不同的調控通路似乎並不能相互補償，阻斷其中任一途徑均可緩解神經病理性疼痛的症狀。

　　此外，組蛋白甲基化修飾也可通過DRG和脊髓內其他信號通路參與神經病理性疼痛的調控，但目前腦內相關研究仍較少，這可能與大腦的複雜性有關。也有研究提示甲基化修飾可以通過調控免疫細胞和膠質細胞內的信號分子參與神經病理性疼痛的過程。

　　 3.甲基化修飾在臨床上的應用

　　盡管多項動物研究提示甲基化修飾參與神經病理性疼痛的調控，但目前臨床研究仍集中在疼痛現象與甲基化修飾的相關性方麵，這可能與臨床試驗的複雜性有關。

　　Tajerian等研究顯示慢性腰背痛患者體內細胞外基質蛋白SPARC(secretedprotein，acidic，richincysteine)表達下降，而SPARC基因啟動子區的甲基化水平則增高，提示DNA的甲基化下調SPARC的表達。與同年齡段健康者比較，女性纖維肌痛症患者總甲基化水平明顯升高。最近一項同卵雙生子研究認為熱痛域的下降與TRPA1基因啟動子區DNA甲基化水平升高有關。SUkenaga研究表明慢性疼痛患者的疼痛症狀與全血細胞中TRPA1的DNA甲基化狀態相關。這些研究提示DNA甲基化可能成為某些疼痛疾病的生物標誌物，我們可能通過檢測甲基化水平評估疼痛症狀及嚴重程度。

　　許多癌症患者可並發神經病理性疼痛。Viet等研究表明口腔癌患者MOR基因啟動子區甲基化水平升高，對口腔癌模型動物應用去甲基化藥物可產生鎮痛作用，這可能由於癌細胞內MOR的再表達導致p-內啡肽分泌增多、神經元激活受抑製所致。最近一項I期臨床研究評估了RRx-001在進展期癌症患者應用的安全性和耐受性。RRx-001在缺氧環境下可被激活，誘導產生活性氧和氮類物質，參與DNA甲基化、組蛋白乙酰化和賴氨酸去甲基化等表觀遺傳調控。該研究雖未直接探討RRx-001的鎮痛作用，但其在癌性神經病理性疼痛中的作用值得進一步探討，同時也為表觀遺傳調控措施在臨床上的應用提供了借鑒。

　　結合前文可知，甲基化幹預措施通過阻斷相關信號通路的傳導，有可能作為鎮痛藥物或者輔助藥物參與神經病理性疼痛的治療。然而目前針對甲基化修飾的幹預藥物如DNMT抑製劑大多作為抗癌藥物應用，對於非癌性痛患者的治療仍待進一步研究。

　　由於神經病理性疼痛的機製非常複雜，加之臨床標本收集相對困難，特別是組蛋白甲基化修飾特異性標本的取得更加困難，目前研究仍集中在動物模型中，要將動物實驗結論轉化為臨床研究和應用，仍然任重道遠。

　　 4.小結

　　甲基化修飾在神經病理性疼痛的發生發展中發揮重要作用。但目前研究中依然存在許多未解之謎：(1)甲基化修飾究竟是神經病理性疼痛產生的原因還是結果(2)甲基化修飾具體通過何種途徑調控神經病理性疼痛?(3)甲基化修飾作為治療神經病理性疼痛的幹預措施時，如何才能保證特異性?總之，針對DNA和組蛋白甲基化修飾的研究使研究者對於神經病理性疼痛發病機製有了更深入的理解，也為新的診療方案提出提供了思路。

　　來源：臨床麻醉學雜誌2017年1月第33卷第1期