基因治療是最具革命性的醫療技術之一，它是以改變人遺傳物質為基礎的生物醫學治療手段。其中以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯日新月異的發展極大地推動了基因功能研究進程。但是，“基因魔剪”的應用之路並非一帆風順，技術本身存在的局限性極大地限製了其發展。

        近日，單堿基編輯技術開創者、Broad研究所David Liu教授研究團隊在頂級學術期刊Nature發表了最新的基因編輯研究成果，報道了一種被稱為“prime editing”的新型基因編輯技術。該研究革新了CRISPR/Cas9技術，成功在避免DNA雙鏈斷裂的基礎上增加了可執行基因組編輯的類型，減少了基因插入失控和脫靶效應，提高了精準修正率，有望修正約89%的疾病相關人類遺傳變異體!

        CRISPR/Cas9——“基因魔剪”“魔力”受限

        CRISPR/Cas9技術是一種RNA引導的基因組編輯技術，理論上能對基因進行精確敲除、敲入、替換等，從而探究基因功能、修複致病基因，為構建更高效的基因編輯技術提供了可能。但是，大量實驗結果卻指出CRISPR/Cas9對大多數突變的精準修正效率不高，插入缺失副產物導致的基因紊亂引發了群眾對CRISPR/Cas9的猶豫。那麼，“基因魔剪”“魔力”為何受限呢?

        我們知道，CRISPR/Cas9進入細胞後，CRISPR序列可轉錄出 pre-crRNA和tracrRNA，而pre-crRNA、tracrRNA以及Cas9編碼的蛋白將會組裝成一個複合體。gRNA可通過堿基互補配對靶向目標序列，識別出與crRNA互補的前間隔序列，DNA雙鏈將被解開。crRNA將與互補鏈雜交，而另一條鏈則保持遊離狀態。隨後Cas9蛋白剪切crRNA互補的DNA鏈和非互補的DNA鏈，最終形成雙鏈斷裂(DSB)，而生物體自身存在的DNA損傷修複應答機製可將斷裂的上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。

        換言之，CRISPR/Cas9編輯的核心步驟是雙鏈DNA的斷裂，這種斷裂的主要修複方式是非同源末端連接，這是一種錯誤率極高的修複方式，容易發生移碼插入或缺失，進而引發基因功能喪失，這就嚴重限製了CRISPR/Cas9的精準修正率，所以，想要打破這種局限性，就要避免雙鏈DNA的斷裂。

        prime editing——邊切邊補，告別雙鏈斷裂

        既然不想DNA雙鏈一起斷裂，那就隻能分開修正，也就是說要對突變的位置進行“定點”修正。如何實現呢?研究人員將Cas9蛋白與逆轉錄酶，以及一種特殊的gRNA——pegRNA合成一個複合體。pegRNA不僅可以搜索特定的DNA位點，還能在Cas9-逆轉錄酶融合蛋白切割一條DNA鏈後直接用預編輯的遺傳信息替換靶DNA序列，隨後另一種可精確修複的DNA修複方式——同源修複啟動，將新的遺傳信息接入DNA序列。而另一條DNA鏈隻要將這些步驟再實施一次就可正確編輯。這就實現了“邊切邊補”，徹底杜絕了DNA雙鏈同時斷裂引發的錯配危機。

        研究人員指出，prime editing技術能進行12種單堿基的轉化，其最多可以插入44個堿基或刪除80個堿基。他們在人體細胞執行了超過175次的編輯，確定這項技術比傳統CRISPR/Cas9基因修正的精確率更高，效果更好，而且減少了副產物，更降低了脫靶率!

        這項研究指出了一種新穎的基因編輯方案，克服了傳統CRISPR/Cas9的盲點，這就意味著prime editing技術有望成為未來基因編輯領域更為絢爛的明星。當然這需要更多的時間和實驗對其效果加以證明，我們靜候佳音!