2022年1月30日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所趙國屏-趙維課題組在 Sensors and Actuators B：Chemical 期刊發表題為：RT-RPA-Cas12a-based assay facilitates the discrimination of SARS-CoV-2 variants of concern 的研究論文。

        該研究開發了基於RT-RPA和CRISPR-Cas12a聯合技術來檢測和區分SARS-CoV-2突變體的檢測工具——RRCd。該研究通過使用優化的RPA引物以及特異的crRNA， 可快速、準確檢測單堿基突變、小片段缺失的變異株(包括N501Y、T478K 以及ΔH69-V70等)，在Ct<33的臨床樣品中能達到100%的準確性。

        該技術無需依賴其他儀器，可快速、準確地實現即時核酸檢測(POCT)，可應用於家用新型冠狀病毒及其他核酸病毒檢測，相對於抗原-抗體檢測具有靈敏度高，發現早的優勢。

        自2020年11月以來，世界衛生組織已發布了5種廣泛流行的SARS-CoV-2變異株，即 Alpha、Beta、Gamma、Delta 和 Omicron，並指定為“密切關注的突變體”。逆轉錄實時定量PCR(RT-qPCR)作為典型的核酸檢測技術，可以靈敏、準確地定量樣本中的RNA病毒。

        然而，由於RT-qPCR是一種基於擴增子的檢測方法，並不適用於對SARS-CoV-2突變體進行基因分型。目前，對SARS-CoV-2突變體的檢測方法主要基於全基因組測序。可是，全基因組測序不僅依賴於大量儀器和訓練有素的人員，而且耗時長、成本相對高。

        事實證明，與傳統的PCR或全基因組測序等方法相比，基於CRISPR技術的核酸診斷方法在特異性和可操作性方麵具有獨特的優勢。目前，兩種基於CRISPR的SARS-CoV-2診斷方法，即DETECTR和SHERLOCK，已被開發出來並用於SARS-CoV-2檢測，具有快速、超靈敏和易於實施的特點。然而，盡管基於CRISPR的核酸檢測取得了巨大成功，但目前用於SARS-CoV-2突變體的檢測技術仍缺乏。最近，有報告一種名為miSHERLOCK的SARS-CoV-2突變體檢測技術，該方法基於CRISPR-Cas13a技術，使用較少的儀器設備就能提供視覺讀數，從而部分實現了即時檢測。但是，這些方法均未能提供大樣本的臨床數據進行驗證。

        為了解決上述問題，該研究開發了一種快速、靈敏、準確的病原突變體核酸檢測方法。利用CRISPR-Cas12a技術，通過設計特異的crRNA實現對SARS-CoV-2中點突變的識別。同時，將CRISPR-Cas12a技術與膠體金技術相結合，實現對檢測結果的可視化讀取。而且，該方法利用特殊的病毒裂解液，實現了對SARS-CoV-2病毒核酸的直接釋放並無縫銜接後續的擴增和檢測步驟。該研究完全免除了對儀器設備的依賴性，真正實現了即時檢測

        為了檢測本方法對SARS-CoV-2突變變體的特異性和靈敏度，通過設計crRNA並利用優化後的RT-RPA引物分別對SARS-CoV-2假病毒及其含有SARS-CoV-2中ΔH69-V70，N501Y和T478K等突變假病毒進行測定。結果顯示該方法可以很容易地區分了S蛋白中的突變，包括首次報道的Beta譜係的N501Y(圖2A)和最近報道的Delta和Omicron譜係的T478K(圖2C)。此外，它還可以區分S基因上的小缺失，例如來自Alpha和Omicron譜係的ΔH69-V70(圖2E)。為了確定本方法的靈敏度，分別對用於通用檢測的E基因以及S基因的N501、Y501、T478和K478進行檢測。結果顯示，所有靶標區域(E基因、N501、Y501、T478和K478)的檢測線約為10個拷貝，相當於RT-qPCR檢測Ct值為35。

        為了進一步評估該方法在SARS-CoV-2突變體臨床樣本方麵的檢測性能，對S基因的501和478位點進行檢測。N501Y作為Alpha、Beta、Gamma和Omicron等變異體的常見突變位點。該方法對共采集到的68份臨床樣本進行了突變體檢測。在這68份臨床樣本中，經過基因組測序鑒定有28份為N501樣本和19份為Y501樣本。結果顯示，在Ct <33樣本中能夠區分所有突變體(圖3A)。然而，當檢測Ct值超過33的樣本時，本方法的辨別能力顯著下降，這可能是受限於S基因501位點的靈敏度。S基因478位點可用作識別Delta和Omicron譜係的重要靶標，本次研究中共收集了40個臨床陽性樣本，經基因組測序鑒定包括7個T478 樣本和14個K478樣本。結果顯示能夠區分所有靶向S基因的478位點(圖3B)。綜上所述，這些臨床數據表明，本研究能夠準確、靈敏地檢測和區分SARS-CoV-2突變體。

        中科院深圳先進院合成生物學研究所趙國屏院士、趙維副研究員，上海國際旅行衛生保健中心副主任田楨幹為論文共同通訊作者，中科院深圳先進院合成所的研究助理唐桂月、上海國際旅行衛生保健中心張子龍博士及中科院深圳先進院合成所的助理研究員譚為為共同第一作者。該研究得到王金教授、戴珩博士和楊曉楠博士的建議和幫助，得到張先恩教授課題組提供的假病毒支持。該研究得到國家科技部重點研發計劃、中科院先導b、國家自然科學基金委、深圳合成生物學創新研究院等多個項目支持。

        原始出處：

        Guiyue Tang， et al. RT-RPA-Cas12a-based assay facilitates the discrimination of SARS-CoV-2 variants of concern. Sensors and Actuators B： Chemical， Volume 381， 15 April 2023， 133433.